(2)测定

①微管柱的真菌制备：以大批脱脂棉作底用铁丝扎实，置于微管柱管架上，毒素的魔挨次退出高为0.5cm无水硫酸钠(80～100目)、真菌0.5cm硅镁型吸附剂、毒素的魔0.5cm无水硫酸钠(80～100目)、真菌1.5cm中性氧化铝，毒素的魔1.5cm酸性氧化铝、真菌3cm无水硫酸钠(40～80目)，毒素的魔顶部以大批脱脂棉窒息，真菌装试剂时管要垂直，毒素的魔每一装一种试剂要适量敲紧，真菌两种试剂之间界面要平齐，毒素的魔柱管要随装随用，真菌省患上在空气中吸水活性着落。毒素的魔

②微柱色谱：在装好的真菌微柱中，退出三氯甲烷提取液1.0mL，同时做规范管，另取三支微管柱，各退出三氯甲烷1.0mL，再分说退出黄曲霉毒素B₁规范液(0.1μg/mL)0pL、50μL、100μL，至关于黄曲霉毒素B1规范0ng、5ng、10ng，待加液流制顶层时，即退出1.0mL丙酮-三氯甲烷(1+9)睁开剂，在加样或者睁开时，柱管均要连结垂直，待睁开剂流完后，即可审核服从。

③服从审核与评定：于波长365nm紫外光灯下审核，将色谱别离后的样品管挨次与0μg、5μg、10μng黄曲霉毒素B₁规范管比照。若试样柱管内硅镁型吸附层与0管不同，则为阴性(在5μg/kg如下)；如试样管中硅镁型吸附层呈蓝紫色荧光环，则为阴性，并需进一步按薄层色谱法妨碍确证测定，但不需重新提取试样。其操作为：精确排汇原三氯甲烷提取液4.0mL(至关于4g或者8g试样)于小蒸发皿内挥干，以大批苯-乙腈搅浑液(98+2)分数次转入刻度小管中，定容至1.0mL，密塞，混匀，按薄层色谱法确证，并测定黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₃、黄曲霉毒素G₂的含量。

(三)功能液相色谱法

一、道理

试样经乙腈-水提取，提取液过滤后，经装有反相离子替换吸附剂的多功能传染柱，去除了脂肪、卵白质、色素及碳水化合物等干扰物资。传染液中的黄曲霉毒素以三氟乙酸衍生，用带有荧光检测器的液相色谱系统合成，外标法定量。

二、试剂以及资料

①黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素岛、黄曲霉毒素G₂、黄曲霉毒素G₂的规范品，纯度＞99%。

②乙腈：色谱纯、合成纯。

③三氟乙酸：合成纯。

④ 己烷合成纯。

⑤ 水：电导率(25℃)≥0.01mS/m。

⑥ 乙腈-水(84+16)提取液：量取乙腈(合成纯)840mL，加水160mL，混匀。

⑦ 水-乙腈(85+15)溶液：量取乙腈(色谱纯)150mL，加三蒸水850mL，混匀。

⑧ 规范蕴藏液：分说称取黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂0.2000g、0.0500g、0.2000g、0.0500g(精确至0.001g)，置10mL容量瓶中，加乙腈(合成纯)消融，并稀释至刻度。此溶液密封后避光-30℃保存，2年实用。

⑨规范使命液：精确移取规范蕴藏液1.00μL，至10mL容量瓶中，加乙腈(合成纯)稀释至刻度。此溶液密封后避光4℃保存，3个月实用。

⑩准系列溶液：精确移取规范使命液过多，至10mL容量瓶中，加乙腈(合成纯)稀释至刻度(含黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素G_l的浓度为0.00μg/L、0.5000μg/L、1.000μg/L、2.000μg/L、5.000μg/L、10.00μg/L、25.00μg/L、50.00μg/L、100.0μg/L；黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₂的浓度为0.00μg/L、0.1250μg/L、0.2500μg/L、0.5000μg/L、1.250μg/L、2.500μg/L、6.250μg/L、12.50μg/L、25.00μg/L的系列规范溶液)，留意避光。

三、仪器以及配置装备部署

①液相色谱系统(HPLC)：附荧光检测器。

②色谱柱：反相C₁₈柱，要求4种毒素的峰可能达到基线别离。

③含有反相离子替换吸附剂的多功能传染柱：Mycosep^TM226MFC柱或者Mycosep^TM228MFC柱(或者其余等效产物)。

④电动振荡器。

⑤漩涡搅浑器。

⑥烘干箱。

⑦离神思。

⑧真空吹干机，或者氮气及水浴锅。

⑨天平：感量为万分之一。

四、合成步骤

(1)试样提取：称取20g经短缺破碎捣毁过的试样至250mL锥形瓶中，退出80mL乙腈-水(84+16)提取液，在电动振荡器上振荡30min后，定性滤纸过滤，收集滤液。

(2)试样传染：移取约8mL提取液至少功能传染柱的收集池中。

(3)试样衍生化：从多功能传染柱的收集池内转移2mL传染液到棕色具塞小瓶中，在真空吹干机下60℃±1℃吹干(或者在60°C：水浴下氮气吹干，留意不要使液体鼓泡、飞溅)。退出200μL正己烷以及100μL三氟乙酸，密闭混匀30s后，在40℃±1℃烘干箱中衍生15min。室温真空吹干机吹干(或者室温水浴下氮气吹干)，以200μL水-乙腈(85+15)消融，混匀30s，1000r/min离心15min，取上清液至液相色谱仪的样品瓶中，供测定用。

(4)规范系列溶液的制备：排汇规范系列溶液各200μL，在真空吹干机下60℃吹干(或者在60℃水浴下氮气吹干，留意不要使液体鼓泡、飞溅)，衍生化方式同(3)。

(5)测定

①色谱条件

a．色谱柱 12.5cm×2.1妹妹，5μm，C₁₈。柱温30℃。

b．行动相 乙腈(色谱纯)，水，梯度洗脱的变换参考下表。调整洗脱梯度，使4种黄曲霉毒素的保存光阴在4～25min。

c．其余条件 流速0.5mL/min。进样量25μL。荧光检测器：激发波长360nm；发射波长440nm。

②测定：黄曲霉毒素遵照黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂的挨次出峰，以规范系列的峰面积-浓度分说绘制每一种黄曲霉毒素的规范曲线。试样经由与规范色谱图保存光阴的比照，判断每一种黄曲霉毒素的峰，依据每一种黄曲霉毒素的规范曲线及试样中的峰面积，合计试样中种种黄曲霉毒素含量。

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