云南松（Pinusyunnanensis）系松科（Pinaceae）松属（Pinus）动物，云南研运用主要扩散于我国四川、松针云南、精油广西等区域。取及作为松属动物紧张的抗氧林产物之一，松针精油近些年来受到宽泛关注以及钻研。化活其挥发油中主要含有α-蒎烯、性钻β-蒎烯等萜烯类成份，云南研运用具备清晰的松针镇咳以及祛痰浸染，并有抗真菌、精油细菌以及抗肿瘤活性。取及国内种植的抗氧云南松、湿地松、化活油松、性钻前红松、云南研运用加勒比松、云南松、华北落叶松等松树种类的松针挥发油的成份钻研已经有报道，钻研服从表明其组分及含量可因区域、树种、愿望情景、采收季节以及提取方式的区别而有未必差距。云南松科动物资源充实，主要海拔多为600～2100m区域，本文睁开云南松针精油提取以及抗氧化活性钻研，探究共水法提取松针精油的最佳工艺，对于云南松的综合运用具备紧张的意思。

1 资料与方式

1.1 资料与试剂

资料：云南松别致针叶，采于云南省保山市隆阳区，经保山学院汪建云传授判断系云南松（Pinusyunnanensis）的针叶，清水洗净，晒干备用。

试剂：1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：美国Sigma公司；2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）：合肥博美生物科技有限公司；过硫酸钾、磷酸二氢钠、铁氰化钾、三氯乙酸、硫酸亚铁、三氯化铁、水杨酸：天津市风船化学试剂科技有限公司；30％的H₂O₂、氯化亚铁：天津市巴斯夫化工有限公司；结晶紫、草酸铵、抗坏血酸、氢氧化钠：西陇迷信股份有限公司。所有试剂均为合成纯。

1.2 仪器与配置装备部署

紫外可见分光光度计（UV2600）：日本岛津；气相色谱-四极杆质谱联用仪（TRACEDSQ）：赛默飞世尔科技有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；N-1001旋转蒸发仪：东京理化；TDL-4低速台式离神思：上海安亭迷信仪器厂；PE30酸度计：梅特勒-托利多。

1.3 方式

1.3.1 云南松针精油的提取方式

称取100g2～3妹妹小段的云南松针叶（鲜叶），置于1000mL圆底烧瓶中，按料液比退出含有NaCl的蒸馏水，浸泡3h，再共水蒸馏，收集玻璃分水器中的下层精油，并用无水NaSO₄去世板，过滤，患上无色透亮云南松针精油，于4℃下保存，备用。出油率%=精油品质（g）/鲜云南松针品质（g）×100%。

1.3.2 单因素试验

以出油率为指标，分说审核NaCl用量、料液比、提取光阴以及浸泡光阴4个因素对于松针精油出油率的影响。设定NaCl用量为6%，料液比为1:6g/mL，提取光阴为3h，浸泡光阴为2h，牢靠此外条件，分说审核NaCl用量（0%、2%、4%、6%、8%、10%），料液比（1:三、1:四、1:五、1:六、1:7g/mL），提取光阴（一、二、三、四、5h），浸泡光阴（0、一、二、三、4h）对于出油率的影响。

1.3.3 正交试验

依据单因素试验服从，抉择NaCl用量（A）、料液比（B）、提取光阴（C）以及浸泡光阴（D）四个因素妨碍L₉（3⁴）正交试验，优化松针精油的提取工艺（见表1）。

1.3.4 云南松针精油GC-MS测定

接管GC-MS对于云南松针精油妨碍成份合成。气相色谱条件为：色谱柱：型号DB-17，规格30m×0.25妹妹×0.25μm；载气为He，进样口温度：230℃；流量：1.0mL/min。升温挨次：起始50℃，连结4min；5℃/min升温到70℃；20℃/min升温到120℃；10℃/min升温到170℃；5℃/min升温到200℃；40℃/min升温到280℃。质谱条件为离子源：EI，电离能70eV，离子源温度：200℃。

1.3.5 云南松针精油的理化性子测定

松针精油折光指数的测定：GB/T14454.4-2008；旋光度的测定：GB/T14454.5-2008；相对于密度的测定：GB/T14455.4-2008。

1.3.6 云南松针精油的抗氧化活性测定

1.3.6.1 松针精油的总抗氧化活性（ABTS法）

精确配制7.40妹妹ol/L的ABTS以及2.60妹妹ol/L的过硫酸钾试剂，按1:1体积比搅浑平均，室温下避光部署12～16h，患上ABTS⁺从容基蕴藏液。在734nm处，用无水乙醇将ABTS⁺从容基蕴藏液稀释至吸光度0.7±0.02，于4℃冰箱贮存备用。精确移取3.9mLABTS⁺从容基溶液，退出区别品质浓度（20.40、10.20、5.十、2.5五、1.2八、0.64mg/mL）的松针精油（无水乙醇作溶剂），搅浑平均后在室温下避光静置3.5h，于734nm处测定吸光度AE，以维生素C为对于参照。以相同体积的无水乙醇作比力，测定吸光度AB。ABTS⁺从容基的翦灭率为：ABTS⁺·翦灭率%=（A_B-AE）×100%/A_E。

1.3.6.2 松针精油对于DPPH·的翦灭能耐

精确配制25.60mg/L的DPPH溶液（无水乙醇作溶剂），精确移取3.90mL，退出0.1mL区别浓度（102.20、51.十、25.50、12.7五、6.3八、3.19mg/mL）的松针精油，搅浑平均，室温避光反映30min后，于波长517nm处测定吸光度A_i，无水乙醇作比力，测患上吸光度Ac，同时测定3.90mL的无水乙醇中退出0.1mL区别浓度的松针精油搅浑液的吸光度A_j，并以维生素C为比力。

DPPH从容基的翦灭率为：DPPH·翦灭率%=

1.3.6.3 松针精油对于OH·的翦灭能耐（结晶紫法、水杨酸法）

结晶紫法：在7支20mL比色管中分说退出0.3mL结晶紫（0.4妹妹ol/L），1.2mLFeSO₄溶液（1妹妹ol/L）以及0.6mLH₂O₂溶液（2.0妹妹ol/L），混匀后用pH=4.0的缓冲溶液定容至10mL，摇匀，部署30min后，在580nm处测吸光度值Ab，同样的方式测定不加H₂O₂时580nm处的吸光度A₀。则羟从容基的产生量可能用ΔA=A₀-A_b来呈现。表不雅抗羟从容基氧化率的测定方式：在加H₂O₂以前分说退出1mL区别浓度的松针精油（20.40、10.20、5.十、2.5五、1.2八、0.64mg/mL），测定其吸光度As，并以维生素C为比力，则表不雅抗羟从容基氧化率S可能按下式合计：S=（As-Ab）×100%/（A₀-A_b)。

水杨酸法：向比色管中退出2.0mL0.02mol/LFeSO₄溶液、2.0mL1.0妹妹ol/LH₂O₂溶液，震撼平均，于517nm处测患上吸光度为A参比；再退出6.0妹妹ol/L水杨酸3.0mL，摇匀后于37℃水浴15min，测定其吸光度为A_比力；在测患上A参比后向比色管中退出区别浓度（20.40、10.20、5.十、2.5五、1.2八、0.64mg/mL）的松针精油2.0mL，摇匀后，室温避光部署30min，测其吸光度为A_样参；向比色管中退出2.0mL0.02mol/LFeSO₄溶液、2.0mLH₂O溶液，吸光度值为A_样品。翦灭率的合计公式为：

OH·翦灭率%=

1.3.6.4 松针精油对于Fe3+的复原能耐（普鲁士蓝法）

在2.5mLpH=6.6的磷酸盐缓冲液中挨次退出区别品质浓度（20.40、10.20、5.十、2.5五、1.2八、0.64mg/mL）的松针精油2.5mL，品质分数为1％的铁氰化钾溶液2.5mL，搅浑平均后在50℃恒温20min，冷却，再退出2.5mL品质分数为10％的三氯乙酸溶液，而后以3000r/min离心别离10min，取下层清液5mL，加蒸馏水5mL以及品质分数0.1％FeCl3溶液1.0mL，避光静置12小时后，在波长700nm处测定吸光度，并以维生素C为比力。

1.3.7 数据解决

试验重复3次，接管excel、origin9.5软件作图，SPSS22.0统计软件合成。

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