酱油因其滋味鲜美、强化口感醇厚，嗜盐成为人们餐桌饮食的联球紧张调味品。当初，菌对酵国内外的于模盐酱油发影响酱油酿造工艺主要有低盐固态工艺以及高盐稀态工艺两种。低盐固态发酵工艺最后是拟低为了改善无盐固态发酵酱油的风韵而提出的，此工艺具备发酵温度高、强化可能抑制杂菌、嗜盐质料运用率高以及斲丧晃动的联球短处，而且周期较短、菌对酵易于大规模斲丧，于模盐酱油发影响是拟低我国大全副酱油斲丧企业主要釆用的发酵工艺。可是强化相较于高盐稀态发酵工艺，酶浸染周期比照短，嗜盐酯香味缺少，联球斲丧的酱油以中高档为主。

高盐稀态发酵工艺是把质料经由蒸煮或者焙炒、制曲后与20%左右的盐水混分解酱醪，经由发酵制成酱油。该工艺尽管周期长、质料运用率低，可是后发酵短缺、味醇香浓，是厂家斲丧高档酱油的首选工艺。可是高盐稀态酱油中较高的盐浓度（18%～22%）存在引起高血压、血汗管等疾病的潜在危害，可能会影响人体瘦弱。食物法典委员会（codexalimentariusco妹妹ission,CAC）倡导将饮食中盐的摄入量从9g/d削减到6g/d，天下卫负气关（worldhealthorganization,WHO）以及食粮及农业机关（foodandagricultureorganization,FAO）倡导逐日盐摄入量不超过5g/d。以是食用低盐发酵酱油已经成为一种趋势，普及下盐发酵酱油的品质已经成为行业内亟待解决的成果。

酱油发酵是典型的混菌发酵历程，多种微生物退出其中并发挥浸染，主要有曲霉、酵母菌、乳酸菌以及其余细菌，其中酵母菌以及乳酸菌在酱油发酵历程中发挥紧张浸染。鲁氏接合酵母（Zygosaccharomycesrouxii）、埃切假丝酵母（Candidaetchellsii）以及易变球拟酵母（Torulopsisversatilis）与酱油发酵的关连最为亲密，其中钻研以及运用至多的是鲁氏接合酵母。鲁氏接合酵母是酱醪中的劣势微生物，主要浸染于酱油发酵前期，除了能天生多种醇类，还能退出含硫化合物等风韵物资的组成，带给酱油愈加重大以及醇厚的香气。当初，家养削减鲁氏接合酵母的成果清晰、技术成熟，并受到了不同认可。

乳酸菌种类多、总量大，可能发酵葡萄糖天生酸类物资，是影响酱油发酵的紧张微生物。嗜盐四联球菌（Tetragenococcushalophilus）是一类退出酱油发酵的耐盐乳酸菌。嗜盐四联球菌具备多种氨肽酶，能退出氨基酸的次级代谢以及醇醛之间的转化。在酱油斲丧历程中强化嗜盐四联球菌以及酵母菌，能经由菌株间的协同浸染使酱油风韵愈加充实。已经有钻研表明，削减两种酵母菌（Z.rouxii以及皱状假丝酵母（Candidaversatilis））以及嗜盐四联球菌可能使酱油中醇类、酯类、酸类以及吡嗪类等物资含量清晰削减，挥发性物资总量普及2.2倍。嗜盐四联球菌对于低盐酱油防腐有着未必的被动意思，其可能运用葡萄糖产生高浓度乳酸。乳酸不光能给予酱油以及顺的酸味，而且酱油发酵历程中连结未必浓度的乳酸能实用抑制重大芽胞杆菌（Bacillusmegatherium）为主的酱油蜕变胀瓶传染菌，有利于废品酱油的品质牢靠。此外，嗜盐四联球菌还能削减胺类危害物的含量。

钻研发现，酵母菌以及乳酸菌在酱醪中存在经由物资代谢产生的拮抗浸染，乳酸菌以及酵母菌的削减需要有未必的距离期，而且其削减量对于酱醪发酵也有清晰影响。本钻研以经由模拟低盐酱油快捷发酵，在削减鲁氏接合酵母的根基上，审核嗜盐四联球菌区别削减量对于酱醪理化指标、氨基酸以及有机酸含量、挥发性风韵物资等的影响，揭示其发酵功能，为普及下盐发酵酱油品质提供事实参考。

1资料与方式

1.1资料与试剂

1.1.1菌株

酱油曲精（米曲霉（Aspergillusoryzae）沪酿3.042）：久味食物科技有限公司；嗜盐四联球菌R4四、鲁氏接合酵母ZQ02：别离悔改颖酱醪，保存于本试验室。

1.1.2作育基

嗜盐四联球菌作育基接管MRS肉汤作育基：英国Oxoid公司。运历时削减NaCl100g/L,pH7.0。固体作育基中削减琼脂20g/L。

鲁氏接合酵母作育基接管酵母浸出粉胨葡萄糖作育基（yeastextractpeptonedextrose,YPD）：北京索宝来科技有限公司。运历时削减NaCl50g/L,pH5.0。固体作育基中削减琼脂20g/L。

嗜盐四联球菌计数作育基接管MRS固体作育基：英国Oxoid公司。运历时削减纳他霉素0.1g/L、NaCl100g/L,pH7.0。

酵母菌计数作育基[5]接管孟加拉红固体作育基：青岛宝博生物科技有限公司。运历时削减丙酸钠5g/L、NaCl100g/L,pH5.0。

以上作育基均115℃灭菌30min。

1.1.3试剂

酵母膏、胰卵白胨（均为生化试剂）：英国Oxoid公司；氨基酸标样、邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde,OPA）（色谱纯）：美国Agilent公司；纳他霉素（纯度96%）：青岛宝博生物科技有限公司。

1.2仪器与配置装备部署

867pH计、ME204电子天平：瑞士Mettler-Toledo公司；MultiskanFC酶标仪：美国赛默飞世尔科技有限公司；PegasusGC-HRT4D+气相-高通量飞翔光阴质谱仪：美国力可公司；UV-1240紫外可见分光光度计：日本岛津公司；1260功能液相色谱（highperformanceliquidchromatography,HPLC）仪：美国安捷伦公司。

1.3方式

1.3.1菌株作育

嗜盐四联球菌的作育：从甘油管中取过多嗜盐四联球菌菌液，接种至嗜盐四联球菌固体作育基，30℃活化作育5d。从活化平板上挑取单菌落接种到嗜盐四联球菌液体作育基中，30℃静置作育60h，按1%(V/V）的接种量接种至嗜盐四联球菌液体作育基，30℃静置作育至OD600nm值达到1.2（菌体浓度1.2×10⁸CFU/mL），备用。

鲁氏接合酵母的作育：从甘油管中取过多鲁氏接合酵母菌液，接种至鲁氏接合酵母固体作育基，30℃活化作育2d。从活化平板上挑取单菌落接种到鲁氏接合酵母液体作育基中，30℃、220r/min作育30h，按1%(V/V）的接种量接种至鲁氏接合酵母液体作育基，30℃、220r/min作育至OD600nm值达到4.0（菌体浓度6.4×10⁷CFU/mL），备用。

1.3.2模拟低盐酱油快捷发酵工艺

制曲工艺：将黄豆粉以及1.2倍的水搅浑平均后在121℃下灭菌15min，冷却至室温后，把黄豆粉、炒熟的小麦粉（品质比为6∶4）以及酱油曲精（质料总品质的1.5‰）短缺拌匀。在生化作育箱中30℃作育48h，适时翻曲，曲料外表长满菌丝即为成曲。

发酵工艺：将成曲用研钵碾碎，与盐水（100g/LNaCl）以体积比1.0∶2.5搅浑。将搅浑后的酱醪分装入2L坛子中，30℃发酵30d，时期天天搅拌一次。在发酵第0、五、十、1五、20、25以及30天妨碍取样。

菌株的削减方式及削减量：模拟低盐酱油快捷发酵历程菌株的削减方式及削减量见表1。发酵开始时（pH5.2左右）削减10⁷CFU/g鲁氏接合酵母ZQ02(Z)。嗜盐四联球菌削减光阴为发酵10d，削减量分说为10⁶CFU/g(Z+T(10））、10⁷CFU/g(Z+10×T(10））、10⁸CFU/g(Z+100×T(10））。

1.3.3嗜盐四联球菌以及酵母菌数目的测定

接管平板计数法测定嗜盐四联球菌以及酵母菌数目。称取1g别致酱醪以及99mL心理盐水混匀，梯度稀释后涂布到计数作育基上，30℃作育3～6d妨碍计数。嗜盐四联球菌为兼性厌氧菌，菌落较小，平板作育需要4～6d。因此，MRS平板计数时可能以及酱醪中劣势耐盐细菌（包罗魏斯氏菌（Weissella）、芽孢杆菌（Bacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus））分说。本方式所合计的酵母数目包罗削减的鲁氏接合酵母以及酱醪中的其余耐盐酵母，后者与前者比照数目较少，可轻忽不计。

1.3.4酱醪理化指标的测定

取100g酱醪，12000r/min离心30min，用孔径为0.22μm的滤膜过滤上清液后妨碍测定。酱醪pH值接管详尽pH计测定。总酸含量接管酸度计法测定。复原糖含量接管3,5-二硝基水杨酸法（3,5-dinitrosalicylicacid,DNS）测定。氨基酸态氮含量接管甲醛滴定法测定。

1.3.5酱醪游离氨基酸的测定

游离氨基酸接管功能液相色谱法测定，接管OPA妨碍柱内衍生化，详尽测定方式参照文献。

1.3.6酱醪有机酸的测定

有机酸接管功能液相色谱法测定，详尽方式参考文献。

1.3.7酱醪挥发性风韵物资的测定

挥发性风韵物资接管顶空固相微萃取（headspacesolidphasemicro-extraction,HS-SPME）散漫气质联用技术（gaschromatography-massspectrometer,GC-MS）妨碍测定，详尽方式参考文献。测定后将样品质谱图与美国国家规范与技术钻研院（nationalinstituteofstandardsandtechnology,NIST)2.0规范谱库比对于判断，依据保存指数（retentionindex,RI）对于挥发性物资遏制定性，依据内标2-辛醇（83.36μg/L）的峰面积对于挥发性物资妨碍半定量合成。

1.3.8数据解决方式

运用Excel20十二、SPSS19.0对于数据妨碍解决合成，运用Origin8.五、R语言以及AdobeillustratorCS6对于数据可视化。一着实施均重复3次，服从接管“均值±规范差”的方式展现。

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