作为一种罕有的酵对香辛料，生姜含有多种生物活性成份，于姜油树氧化包罗不挥发且有鼓舞性气息的脂抗姜辣素，具备抗氧化、活性抑菌、酵对散寒、于姜油树氧化活血等浸染。脂抗姜油树脂是活性经超临界CO₂萃取干姜而患上到的半液态搅浑物，短缺保存了生姜的酵对活性成份与特意风韵，是于姜油树氧化人造的香料与防腐剂。但因为其特有的脂抗辛辣鼓舞性气息，使产物不易被公共负责，活性而且姜油树脂中生物活性更高、酵对不良气息较弱的于姜油树氧化姜烯酚类等含量很少，既影响了成果发挥，脂抗也限度了市场运用。当初，对于生姜活性的降职主要接管化学物理方式，功能低，老本高，副浸染还多，而经由微生物发酵普及生姜生物活性方面的钻研较少。

霉是传统发酵工业的优异菌种，可运用差此外质料在特定的条件下发酵以及代谢斲丧人们所需的种种产物，如L-乳酸、L-苹果酸、富马酸以及脂肪酶等，以及其余特同性酶及非凡代谢产物，在食药、环保等畛域的运用也不断开拓。

本试验以乳化姜油树脂为底物妨碍根霉发酵，经由测定根霉生物量、作育物pH、抗氧化活性、发酵液成份等指标，合成根霉发酵对于生姜活性物资抗氧化活性的影响，为高附加值生姜风韵发酵食物的开辟及人造生姜资源劣势的运用提供事实根基。

一、资料与方式

一、资料与配置装备部署

根霉菌株:RhizopusoryzaeMG一、RhizopusoryzaeMG四、RhizopusoryzaeMG5（别离于幽香大曲)，RhizopustonkinesisDMG(别离于东京根霉曲)，安琪根霉AMG(别离于安琪甜酒曲，安琪股份有限公司产物)，均收藏于山西师范大学生物工程试验室。

姜油树脂，青岛利以及萃取股份有限公司产物；PDA作育基、琼脂粉，青岛海博生物技术有限公司产物，DPPH、ABTS，TPTZ、水溶性维生素E，北京伊诺凯科技有限公司品，乙酸乙酯、甲醇、乙酸、乙酸钠、浓盐酸、过硫酸钾、吐温-80，天津市科密西化学试剂有限公司产物；FeCl₃·6H₃O，上海展云化工有限公司产物。以上试剂均为合成纯6-、8-、10-姜酚(6-G、8-G、10-G)以及6-、8-、10-姜烯酚(6-s、8-S、10-S)规范品，美国Chromadex公司，色谱甲醇，色谱乙腈，赛默飞世尔科技公司；超纯水，娃哈哈有限公司。

FA2204B型电子天平，上海精科产物；YXO-LS-50SI型低压蒸汽灭菌锅、SW-CJ-2FD型超净使命台，上海博讯产物:HPX-9272MBE型数显电热作育箱，上海一恒产物:SHA-C型水浴恒温振荡器，上海福玛试验配置装备部署有限公司产物:pH-3C型pH计，上海雷磁产物；5804R型高速冷冻离神思，德国基因有限公司产物；HH-6型数显恒温水浴锅，江苏金坛凋敝仪器制作有限公司产物；752N型紫外可见分光光度计，上海仪电合成仪器有限公司产物；1260LC功能液相色谱仪，安捷伦科技有限公司产物。

二、试验方式

（1）菌种活化及胞子悬液制备

将收藏的根霉菌株接种于马铃薯葡萄糖(PDA)液体作育基，28℃震撼(150r/min)活化三天后转接于PDA斜面作育基上28℃作育4d，此时菌丝长满玄色的胞子，用无菌心理盐水洗涤斜面制备胞子悬液，稀释调节胞子悬液浓度约5x10⁵/mL，28℃震撼(150r/min)作育8h，匆匆使胞子萌生，备用。

（2）姜油树脂预解决

取10mL吐温-80置于棕色瓶中，低压蒸汽灭菌后退出10mL姜油树脂，搅拌平均，使姜油短缺乳化，退出无菌水80mL，稀释10倍，搅拌平均备用。以上步骤均需无菌操作。此状态下姜油树脂乳浊液系统平均，在室温下静置或者冷藏状态下均不会发生油水份层。后文削减量按乳浊液中姜油树脂的实际体积合计。

（3）发酵液预解决

在20mLPDA液体作育基中接种1%的胞子悬液，削减过多姜油树脂稀释液为底物，28℃震撼(150r/min)作育4d。将发酵液全副移入离心管，残渣用5mL蒸馏水洗涤后移入离心管，离心管中退出15mL乙酸乙酯，搅浑平均后6000r/min离心20min，用医用注射器排汇乙酸乙酯上清液，氮吹去世板，甲醇定容至10mL，-20℃冰箱贮存。以根霉发酵后，再削减姜油树脂为比力。

（4）根霉生物量的测定

姜油树脂削减到PDA液体作育基中与根霉共发酵，每一8h取样测定作育物pH与菌丝湿重，绘制响应的pH曲线与愿望量曲线。

（5）根霉发酵姜油树脂条件的单因素试验

在20mLPDA液体作育基中削减过多姜油树脂，接种1%的胞子悬液，抉择姜油树脂削减量、发酵温度及发酵光阴妨碍单因素试验。牢靠发酵温度35℃以及发酵光阴4d，钻研分说削减10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL、100μL、120μL、140μL、160μL、180uL、200μL姜油树脂经发酵后的总抗氧化活性。牢靠姜油树脂削减量70μL与发酵光阴4d，钻研20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃下姜油树脂经发酵后的总抗氧化活性。牢靠姜油树脂削减量70μuL与作育温度35℃，钻研经1～7d发酵后姜油树脂的总抗氧化活性。

（6）根霉发酵姜油树脂条件的响应面合成

以单因素试验为根基，选姜油树脂削减量、发酵温度与发酵光阴为自变量，发酵后姜油树脂的总抗氧化活性为响应值，运用DesignExpertversion8.06(MinneapolisMN，USA)软件的BBD(Box-Behnkendesign)挨次，妨碍响应面优化妄想妄想，其中的方差合成(analysisofvariance，ANOVA)挨次用于试验数据合成以及模子拟合，由模子合计最高抗氧化活性以及对于应的区别因素的最佳水平。

（7）抗氧化活性评估

参考郭京波等的试验方式。测定发酵后姜油树脂的DPPH、ABTS从容基翦灭能耐及Fe3+复原能耐(FRAP)，合计3种抗氧化活性评估服从的总以及，即总抗氧化活性(TAC)，单元为umolTE(水溶性维生素E)/gGingeroleoresin(姜油树脂)。

（8）姜油树脂活性成份功能液相色谱合成

发酵实现后，将锥形瓶放入真空去世板箱，将作育基蒸干后退出5mL甲醇，超声萃取5min，第二次与第三次各退出5mL超声辅助萃取5min，使作育基中的生姜活性物资短缺溶入甲醇，并吞萃取液以甲醇定容至20mL后-20℃贮存，妨碍功能液相色谱合成时取过多用0.22μm的尼龙膜过滤落伍样。

用甲醇配制0.2m/mL的6-、8-、10-姜酚以及6-、8-、10-姜烯酚规范品母液，-20℃冰箱贮存。功能液相色谱操作条件:检测波长280nm，进样体积10uL；流速1.0mL/min；柱温48℃；运行光阴62min；行动相A为乙腈，B为1%的冰醋酸。梯度洗脱条件为:0～10min，45%A；10～20min，65%A；20～40min，95%A；40～50min，100%A；50～62min，45%A。

二、服从与品评辩说

一、区别根霉菌株发酵姜油树脂作育物抗氧化活性的比照

为比照区别根霉菌株发酵姜油树脂的能耐，选取试验室收藏的五株根霉妨碍发酵，即R.oryzaeMG一、R.oryzaeMG4.R.oryzaeMG五、R.tonkinesisDMG、AMG，在20mLPDA液体作育基中削减50μL姜油树脂，分说接种1%的胞子悬液，28℃震撼(150r/min)作育4d后，以DPPH法、ABTS法、FRAP法测定抗氧化活性，并合计TAC，服从如见图1。

如图1所示，经MG一、MG四、MG五、AMG、DMG发酵后，姜油树脂的TAC分说1890.51士5.38μmol/g，1543.38土5.35μmol/g，1494.53士3.98μmol/g，1784.97土8.I6μmol/g，1795.12土6.07μmolg。R.oryzaeMGI活性最高，发酵力强，且发酵液气息幽香不鼓舞，姜油树脂辛辣的气息削弱，有淡淡的柠檬香味；MG四、MG五、AMG发酵液的姜油树脂辛辣气息仍是比照清晰；DMG发酵液则会产生使人不悲痛的气息。因尔后续试验抉择R.oryzaeMG1妨碍发酵条件的优化。

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相干链接：富马酸，姜烯酚，过硫酸钾，琼脂粉