黑木耳作为一种贵重的黑木传统食用真菌，不光能为人体提供氨基酸、耳胞卵白质、外多伙食纤维等营养物资，糖对还具备抗氧化、于小疫调影响抗肿瘤、鼠肠生态降血糖以及防御血汗管疾病等多种活性功能。道微黑木耳含有多种营养成份，及免节其中所含多糖成份的黑木浸染钻研较为宽泛，特意是耳胞在食物以及保健品开辟方面具备运用价格，如黑木耳饮料、外多黑木耳口服液等。糖对钻研发现，于小疫调影响黑木耳多糖可能清晰普及机体免疫力，鼠肠生态抑制小鼠脾淋巴细胞转化增殖能耐，道微增强其巨噬细胞吞噬能耐以及人造杀伤细胞活性。肠道微生物是人体的紧张代谢“器官”，在消化罗致、新陈代谢以及免疫反映等性命行动中发挥紧张性浸染。随着对于肠道微生物与机体瘦弱钻研的深入，发现个别心理条件下人体肠道菌群处于动态失调状态，当内情景变换或者受到外界鼓舞时，会导致肠道内菌群凌乱，对于机体瘦弱产生影响。比喻，抗生素滥用会破损肠道微生物种群失调，削减炎症性疾病危害。益生菌经由火泌一系列抗菌物资（有机酸、过氧化氢以及细菌素等）着落肠内pH，削减短链脂肪酸（Shortchainfattyacid，SCFA）含量来削减病原体活菌数。钻研发现，多糖可能增长肠道劣势菌增殖以及调节肠道内渗透物，从而增长肠道内情景稳态以及机体瘦弱。

尽管黑木耳具备较高的营养价格以及宽绰的运用远景，可是其多糖成份对于肠道微生物的调控浸染与机制仍不清晰。为清晰了黑木耳多糖对于肠道菌群变换的调控效应及其生物功能，本钻研运用小鼠模子，合成黑木耳胞外多糖对于小鼠肠道菌群多样性、SCFA含质变换及血清细胞因子的影响，为黑木耳多糖益生菌微生态制剂以及新型瘦弱食物的开辟提供事实根基。

1资料与方式

1.1质料与试剂

黑木耳菌株（GenBank：KF297975.1，天津科技大学生物医药与份子生物学试验室保存）。无水乙醇（合成级）、葡萄糖（合成级）、浓硫酸（合成级）、二甲苯（合成级），天津南方天医化学试剂厂；三氯甲烷（合成级）、异戊醇（合成级）、二氯甲烷（色谱级），上海生工生物工程有限公司；乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸，上海源叶生物科技有限公司；柠檬酸钠抗原修复液，上海碧云天生物技术有限公司；牛血无辜卵白，北京索莱宝科技有限公司；GPR43抗体，圣克鲁斯生物技术（上海）有限公司；FIＴC符号的荧光二抗，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒，上海茁彩生物科技有限公司。

1.2试验动物

SPF级近交系CD-1雌鼠18只，体重（20±3）g，试验动物答应证号：SCXK（京）2016-0006，购于北京维通利华试验动物技术有限公司。

1.3仪器配置装备部署

AB204-S型合终日平，梅特勒-托利多仪器上海公司；GH-6000型电热恒温作育箱，天津市泰斯特仪器有限公司；ALPHA2-4/LD型冷冻去世板机，德国CHRIS公司；722型紫外分光光度计，上海精科仪器公司；7890A气相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；BX53正置荧赫然微镜，日本Olympus公司。

1.4黑木耳胞外多糖提取

黑木耳发酵作育参照肖彩霞的方式。发酵液经3000r/min离心20min弃积淀，上清液间接妨碍真空蒸发，稀释至原体积的1/4，退出无水乙醇（体积分数30%），4℃住宿。3000r/min离心20min后，向上清溶液退出去卵白试剂（三氯甲烷异戊醇=1∶4）并磁力搅拌10min，3500r/min离心15min弃积淀，上清液退出无水乙醇（体积分数75%）4℃住宿。4000r/min离心15min取患上积淀物即为粗多糖，将多糖积淀用水复溶后透析12h，每一2h换1次水，随后冷冻去世板，患上到黑木耳胞外多糖。

1.5多糖的判断及单糖组成合成

1.5.1多糖的红外光谱剖析

称取黑木耳胞外多糖1mg，退出过多溴化钾（KBr）粉末于研钵中，短缺研磨后压成透明薄片，随后用NicoletIS10FＴIR光谱仪（ＴhermoScientific，美国）在400～4000cm-1波数畛域内扫描，记实IR光谱。

1.5.2多糖的单糖组成合成

本试验利勤勉用液相色谱仪，散漫PMP（1-苯基-3-甲基-5吡唑啉酮）柱前衍生化法对于黑木耳胞外多糖样品妨碍了单糖组成合成。多糖的水解以及衍生化方式参照王媛媛等钻研。功能液相检测条件如下：C18色谱柱；行动相为0.1mol/LpH6.5磷酸缓冲盐∶乙腈（V/V）=85∶15；流速1mL/min；柱温40℃；检测波长250nm；进样量20μL。

1.6动物试验

1.6.1试验动物分组及解决

将购买的18只瘦弱CD-1雌性小鼠饲养在20～22℃、45%～55%RH的无菌清洁情景中，让其从容进食（市售平凡饲料），适应性喂养7d。将其随机分为2组（每一组9只）即试验比力组（Control），黑木耳胞外多糖组（Fermentation-exopolysaccharide，F-P）。将黑木耳胞外多糖分心理盐水配置装备部署，而后遵照1.5g·kg^-1BW^-1妨碍灌胃解决（每一只小鼠每一次给药体积为0.2mL），陆续灌胃21d；比力组给以等体积的心理盐水解决。

1.6.2小鼠体重及脏器系数

试验时期每一7d记实1次小鼠体重，将两组体重平均值做趋势合成。第21天，脱臼法正法小鼠后，快捷别离肝、脾、心、肺、肾等脏器，脏器用吸水纸吸干后，妨碍称量以及数据网络，最后对于脏器系数及牢靠性妨碍评估。

脏器系数=（脏器品质/体重）×100%。

1.6.3小鼠肠道菌群合成判断

灌胃试验结束后（第21天），无菌网络别致粪便0.1g，放入灭菌管，将待测样品交派森诺生物科技有限公司妨碍菌群判断合成。流程如下：首先提取样品细菌总DNA，而后以微生物核糖体RNA指标序列为靶点，妄想16SrRNAＶ3-Ｖ4区的特同性引物，等温扩增构建文库。构建好的文库经梯度稀释，运用IlluminaMiSeq测序平台高通量测序。测序服从经由生物信息学方式妨碍亚基因组合成以及肠道微生物区系合成。

1.6.4小鼠粪便中SCFAs含量合成

冷冻去世板粪便样品，精确称取50mg样品，退出1.2mL磷酸盐缓冲液（pH7.3）混匀，4℃14000r/min离心20min，排汇上清液至5mL离心管中。每一200μL上清退出0.1mL的稀释后硫酸（体积分数50%），短缺混匀3min，用2mL二氯甲烷（色谱级）妨碍萃取，4℃静置2h，而后用0.22μm有机滤膜过滤。接管气相色谱（GC）检测样品中短链脂肪酸的含量，样品提取方式参照Zhao等并做全副更正。GC合成接管老例HP-FFAP（25m×0.32妹妹，0.5μm）配置装备部署柱，挨次设定参照贾益群等在生物样品脂肪酸提取与合成的钻研服从，并调整其分流比为20∶1。SCFA规范品溶液的配置装备部署以及规范曲线绘制参照孟拓等对于气相色谱-质谱联用法合成肠道炎小鼠短链脂肪酸代谢钻研服从。

1.6.5小鼠结肠GPR43检测

小鼠灌胃21d后，脱臼法正法小鼠快捷别离肠道交武汉google生物科技有限公司制作石蜡切片。取结肠石蜡切片用二甲苯脱蜡解决，经区别浓度梯度乙醇妨碍水化解决后用柠檬酸钠抗原修复液95℃温育15min妨碍抗原修复，并将其冷却到室温，经3%BSA室温敞开解决30min后用GPR43抗体4℃孵育12h，之后用FIＴC符号的荧光二抗室温避光孵育1.5h，再用DAPI室温避光孵育30min，实施封片并住宿风干，于暗室条件下妨碍荧赫然微镜审核。

1.6.6小鼠血清细胞因子测定

小鼠灌胃21d后，经由摘眼球取血，并将血液保存在含有乙二胺四乙酸络合剂（EDＴA）的收集管中，4℃寄存3h。待人造沉降后，用无菌枪头排汇血清，运用酶联免疫法（ELISA）测定小鼠血清中IL-六、IL-10以及ＴNF-α的含量。试验步骤参照上海茁彩生物科技有限公司ELISA试剂盒操作诠释书。

1.7统计学合成

试验服从接管Graphpad5.0合成软件统计合成，t魔难合成各组间清晰性差距，数据以x-±s呈现，当P＜0.05时，觉患上具备清晰性差距。

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相干链接：乙二胺四乙酸，浓硫酸，溴化钾，异戊酸