2.2 自制碳源的微生物运用

实现低老本PHAs斲丧，追寻经济可行且晃动功能分解PHAs的酵法聚羟基脂发酵物料是紧张，特意是斲丧酯的钻研占发酵物料总老本70%–80%的碳源替换物。公平运用自制碳源，肪酸妨碍特意是微生物工农业销毁物料，可能实用着落PHAs的酵法聚羟基脂斲丧老本，削减PHAs的斲丧酯的钻研市场相助力。

2.2.1 农业自制碳源

作为农业大国，肪酸妨碍我国自制碳源储量充实。微生物玉米淀粉经液化、酵法聚羟基脂糖化、斲丧酯的钻研灭酶解决后用于发酵斲丧削减了运用老本，肪酸妨碍因此开辟直接运用玉米淀粉的微生物PHAs斲丧菌株十分紧张。Shamala等筛选出一株能同时实现α-淀粉酶渗透以及PHAs积攒的酵法聚羟基脂芽孢杆菌Bacillus sp.CFR-67。比照于30 g/L的斲丧酯的钻研葡萄糖，当以30 g/L玉米淀粉作为碳源时，CFR-67的生物量以及PHAs分说普及了25%以及50%。假如同时削减5 g/L的麦麸以及米糠水解液，CFR-67的生物量达到10 g/L，PHAs含量着落至5.9 g/L。地中海富盐菌Haloferax mediterranei ATCC 33500运用膨化玉米淀粉以及膨化米糠作为复合碳源时生物量达到140 g/L，PHAs产量达到77.8 g/L。由此可见，直接运用玉米淀粉可能实现高生物量以及高PHAs的积攒。近些年来也有钻研职员试验将米糠、麦麸等农业销毁物用作PHAs的发酵碳源。米糠含有19.9%(W/W)的淀粉以及19.5%(W/W)的脂肪，经水解后可能被重组大肠杆菌E.coli XL1-Blue以及真氧产碱杆菌Ralstonia eutropha NCIMB11599用作分解PHB的碳源。

秸秆经生物炼制患上到的纤维素以及木质素同样可能作为PHAs斲丧的碳源。Li遵照葡萄糖︰木糖︰阿拉伯糖=4︰2︰1的比例模拟纤维素水解液验证其用于PHAs斲丧的可能性。服从呈现，伯克霍尔德氏菌Burkholderia sacchari DSM 17165的PHAs产量占生物量的77%，达到67 g/L。木质素的运用成果远低于纤维素，贪铜菌Cupriavidus basilensis B-8运用途理后的木质素分解PHAs患上率仅482.7 mg/L。

2.2.2 甘蔗炼糖行业自制碳源

甘蔗炼糖行业中的副产物糖蜜以及蔗渣都是斲丧低老本PHAs的事实碳源。以稀释后的甘蔗糖蜜为碳源，枯草芽孢杆菌B.subtilis RS1经由48 h发酵后生物量达到9.5 g/L，PHAs含量达到生物量的70.5%。另一株B.subtilis以酸解决后的甘蔗糖蜜为碳源，经由96 h发酵后生物量达到38.98 g/L，PHAs含量32.25 g/L，PHAs占生物量82.99%。比照于糖蜜，蔗渣的运用难度稍大。蔗渣经酸水解后除了木糖(16.9 g/L)以及葡萄糖(9.7 g/L)外还含有糠醛、乙酸等毒性物资。在10 L发酵罐中妨碍的分批发酵试验证实洋葱伯克氏菌Burkholderia cepacia IPT 048以及B.sacchari IPT 101可能运用蔗渣水解液发酵斲丧PHAs，且这两株菌的生物量都达到4.4 g/L，其中PHAs含量分说达到生物量的53%以及62%。当仅以木糖以及葡萄糖作为搅浑碳源时，这两株菌株的生物量都可能达到60 g/L，PHAs含量占比60%。这表明蔗渣水解液中的毒性物资对于细胞积攒PHAs影响极大，是未来完乐成用运用蔗渣水解液的拦阻之一。

2.2.3 生物柴油行业自制碳源

生物柴油行业每一斲丧100 kg生物柴油将产生10 kg粗甘油，其中甘油占比75%。据报道钩虫贪铜菌C.necator DSM 545可能以粗甘油为底物分解PHB，尽管占比可能达到生物量的59.8%，可是生物量惟独5.7 g/L。此外DSM 545可能将丙酮酸以及粗甘油作为配合碳源分解P(3HB-4HB-3HV)，其中生物量达到45 g/L，PHAs产量达到16.7 g/L，PHAs占比36.9%。同样地，苏云金芽孢杆菌B.thuringiensis EGU45直接运用粗甘油可能实现3.16 g/L生物量以及1.83 g/L PHAs的积攒。钻研服从证实粗甘油可能作为PHAs斲丧的自制碳源，特意是其产量大、老本低以及情景无传染等特色，都为斲丧低老本PHAs提供了可能性。可是当初钻研服从发现运用粗甘油无奈达到PHAs的高产量积攒，经由基因工程伎俩或者发酵调控策略普及粗甘油运用率概况是未来实现粗甘油运用的发展偏差之一。

2.2.4 废水废物

工农业废水废料中富含的有机质经由酸化或者厌氧发酵后转化成的挥发性脂肪酸(Volatile fatty acid，VFAs)，是微生物斲丧PHAs的功能自制碳源。在1 L发酵罐中，R.eutropha H16可能将工农业废水转化的VFAs作为碳源以及底物能量实现P(3HB-co-3HV)的积攒。经48 h发酵后，生物量达到112 g/L，其中PHAs占比83.3%。在江苏省无锡市芦村落妨碍的100 L发酵罐中试试验中，Jia等同样运用酸化后的污水积淀物实现为了PHAs的微生物转化，其中PHAs产量可能达到生物量的59.47%。除了工农业废水废物外，生涯产生的销毁生物资，比喻豌豆皮、马铃薯皮、洋葱皮等[30]生物资资源经酸化后同样可能转化为VFAs，最后用于低老本PHAs的斲丧。

除了此之外，表1中还摆列了其余可能用于低老本PHAs斲丧的碳源，比喻煤油炼制历程中的甲苯、乙苯、二甲苯等苯系化合物、奶酪加工历程中的乳清，油炸食物加工历程中的销毁橄榄油、棕榈油、葵花籽油等动物油。用于微生物发酵斲丧低老本PHAs的事实碳源种类充实，其中来自农业、工业、都市排放以及餐余垃圾的销毁物料源头广、体量大，更适用于低老本PHAs的斲丧。可是大全副自制物料经预解决后碳源浓度低、碳源成份重大多样、毒性化合物存在、生物量高档成果为前期发酵策略的开辟提出了新的挑战。

2.3 高密度发酵策略调控

实现PHAs的高密度发酵是斲丧低老本PHAs的须要条件之一。当PHAs产量相同时，高密度发酵所需的发酵体积更少，在家养老本、配置装备部署老本以及能源斲丧上都市有清晰着落。

2.3.1 高密度发酵策略

PHAs的高密度发酵主要环抱“饱-饥”策略睁开，即经由操作特定营养元素的浓度实现菌株先积攒生物量再积攒PHAs的多阶段发酵调控。补料分批发酵技术以及陆续发酵技术是实现高密度发酵最罕用的两个技术伎俩。Huschner等以氮元素为营养限度条件，遵照0–16 h C/N=十、16–36 h C/N=90以及36–48 h C/N=∞(乙酸330.9 g/L、丙酸147.3 g/L、丁酸106.7 g/L)的调控策略实现为了R.eutropha H16的高密度发酵，其中生物量达到112 g/L，PHAs占比83.3%。Ye等同样以氮元素为限度条件实现为了H.bluephagenesis TD01发酵历程的精准操作。发酵18 h时TD01细胞数目达到1010个并在随后的发酵历程中连结巩固，后续流加的高浓度葡萄糖(800 g/L)全副用于PHAs分解。当发酵结束后TD01生物量达到90 g/L，PHAs占比74%。

Atlic等运用5级陆续发酵罐实现为了C.necator DSM545的陆续发酵斲丧，其中流登程酵液的生物量81 g/L，PHAs占比77%。5级陆续发酵罐中的第一个发酵罐用于DSM545菌体数目的作育，其余发酵罐均用于氮元素限度下的PHA积攒，PHAs斲丧速率达到1.85 g/(L·h)(补料中葡萄糖浓度500 g/L)。上述策略中都要求运用高浓度补料液以削减对于发酵系统的影响，显明纤维素水解液、粗甘油等低碳浓度的自制物料无奈知足这一要求。于是Haas等开辟了一种含有微滤膜进口的发酵罐，发酵清液经微滤膜进口流出，细胞则被保存在发酵罐中。当以50 g/L的葡萄糖作为补料液时患上到生物量148 g/L，PHB占比76%的服从。这一策略怪异地防御了低糖浓度补料导致的发酵体积增大、细胞逃逸等成果，特意是为前期开辟运用低浓度自制碳源提供了思路。

2.3.2 碳源浓度操作

高密度发酵历程中碳源浓度过高过低或者频仍晃动都市严正影响细胞PHAs分解的能耐。Shang等发现葡萄糖浓度连结9 g/L时R.eutropha可能呈现出优异的PHAs积攒能耐，而当葡萄糖浓度在8–12 g/L畛域内晃动时，PHAs的积攒量也会泛起2%的晃动。Alcaligenes eutrophus NCIMB1159九、H.bluephagenesis TD01等菌株也被证切实发酵液中的葡萄糖浓度为10 g/L，即挨近于其半速系数时，菌株可能实现PHAs的功能分解。服从表明操作发酵液中的碳源浓度，有利于普及高密度发酵历程中的PHAs积攒量。

2.3.3 溶氧水平操作

溶氧水平是影响高密度发酵的严主因素之一。高密度发酵前期溶氧量飞快着落组成微氧或者无氧情景，PHAs分解代谢蹊径受抑制，积攒量着落。尽管普及搅拌转速、通宇量概况提供富氧空气可能保障高密度发酵前期的溶氧水平，可是这些措施削减了PHAs的斲丧老本。基因工程伎俩的运用途理了菌株在微氧状态下的适应成果。比喻导入乙醇脱氢酶启动子Padh E的重组E.coli JW2294在微氧情景中实现为了7.8 g/L生物量，64%PHB的积攒。导入由8个透明颤菌血红卵白启动子串联的P8vgb片断的重组E.coli S17-1在微氧情景中的PHB占比达到90%。随后钻研职员发如今重组Halomonas sp.LS21中表白透明颤菌血红卵白可能普及细胞在微氧情景中对于氧气的摄入能耐，发酵结束后生物量达到30.21 g/L，PHB占比75.32%。由此可见运用微氧启动子、概况普及细胞对于氧气的摄入能耐都可能连结细胞在微氧情景下的胞内个别代谢表白。

2.3.4 毒性物资影响

毒性物资积攒是影响高密度发酵的另一个严主因素。高密度发酵历程中毒性物资的不断积攒导致细胞精力着落甚至诞生，最终影响发酵产量。陆续传代进化是目行普及菌株耐受性最罕用、也是最实用的方式。为了解决乙酸、乳酸、富马酸以及甲醇富集导致菌株代谢能耐着落的成果，人造高密度发酵系统被用于H.bluephagenesis TDHCD-R0的陆续传代进化。经由3轮筛选后的TDHCD-R3在生物量以及PHAs积攒方面泛起清晰削减。比照于登程菌株，TDHCD-R3生物量普及了41.7%，PHAs产量普及了8.2%。陆续传代进化同样适用于微生物菌群的优化。可能功能运用北京市小红门污水解决厂废液废物的微生物菌群经由4轮陆续传代进化后才适用于江苏省无锡市芦村落污水解决厂废液废物，其中PHAs积攒量达到菌体生物量的59.47%，远高于登程微生物菌群的PHAs占比(21.5%)。微生物菌群的陆续传代进化可能优化菌群结构、普及底物抉择能耐，甚至菌群在过多氮源以及非VFA存在状态下不积攒PHAs的征兆都患上到了缓解。

2.4 凋谢式发酵策略开辟

微生物发酵法产PHAs历程中能源斲丧的用度占总老本的30%，其中主要会集于无菌化解决历程，如配置装备部署灭菌、作育基灭菌等的蒸汽斲丧。因此有钻研者提出“下一代工业生物技术(Next-generation industrial biotechnology，NGIB)”，即一种凋谢式陆续发酵生物工业技术。

当初NGIB中乐成用于PHAs斲丧的Halomonas sp.TD01是清华大学陈国强团队从艾丁湖筛选取患上的耐盐耐碱菌株，在高盐高碱的情景下可能连结PHAs的功能分解。盐单胞菌TD01曾经实现为了中试级此外凋谢式补料分批发酵以及陆续发酵，这一历程中发酵物料、配置装备部署以及补料无需妨碍灭菌操作，大大削减了灭菌历程的能源斲丧。另一株嗜盐菌H.campaniensis LS21以遵照厨余垃圾以及淡水成份配制的模拟作育基(其中Na Cl浓度为27 g/L，p H为10)实现为了陆续65 d的凋谢式发酵，经基因工程刷新后的重组H.campaniensis LS21在同样条件下实现为了生物量70%的PHB积攒。这为未来直接运用厨余垃圾以及淡水妨碍凋谢式无灭菌发酵提供了可能性。钻研团队发现发酵历程及鄙俚别离提取历程中产生的高盐废水在无需预解决的状态下可能再次实现4批次的PHAs发酵。这不光削减了新水及Na Cl的运用量，还同时解决了高盐高碱发酵废水的解决排放成果。

NGIB的中间是取患上一株可能抵抗噬菌体或者其余菌种熏染的底盘微生物。因此可能用于开辟斲丧PHA的底盘微生物种类繁多，比喻在高碱无灭菌作育基中斲丧乙醇的耐盐碱马氏芽孢杆菌Bacillus marmarensis、在50℃高温无灭菌作育基中斲丧乳酸的凝聚芽孢杆菌Bacillus coagulans WCP10-4等，以及人造界中存在的嗜酸、嗜碱等嗜极微生物都可能开辟用作低老本PHAs发酵斲丧的底盘微生物。

3 展望

随着红色传染的减轻以及煤油资源的干枯，绿色环保资料势必取代传统煤油基塑料。被觉患上是未来最有远景的绿色环保资料PHAs因为其高昂的斲丧老本在奉背运用中受到了极大的限度，因此实现低老本PHAs的工业化斲丧是当初的钻研重点。当初运用分解生物学、基因工程以及代谢工程等伎俩，菌株分解PHAs的能耐曾经患上到清晰降职，但依然无奈知足工业化斲丧要求。未来的钻研偏差将主要会集到两个方面：(1)开辟低老本物料运用技术。比喻运用农业秸秆、餐余垃圾以及废水废物等销毁物料，着落PHAs发酵斲丧的物料老本。(2)开辟NGIB。追寻功能积攒PHA的嗜极微生物，实现PHAs的凋谢式发酵斲丧，可能进一步增长低老本PHAs的工业化斲丧历程。

申明：本文所用图片、翰墨源头《生物工程学报》2021年2月，版权归原作者所有。如波及作品内容、版权等成果，请与本网分割

相干链接：发酵，芽孢杆菌，纤维素，乙醇脱氢酶