乳酸乳球菌胞外多糖（EPS）为乳酸菌在愿望代谢历程中渗透到细胞壁外的乳酸乳球一类多糖类化合物。因为乳酸菌比照其余工业用菌牢靠性高，菌胞故近些年来对于乳酸菌胞外多糖的外多钻研也逐步削减。从已经有的糖提钻研服从来看，分解EPS的取纯乳酸菌中乳酸乳球菌分解能耐较强，为80～600mg/L。化工胞外多糖作为食物削减剂，艺钻研可用作多种食物的乳酸乳球增稠剂、晃动剂、菌胞乳化剂以及凝胶剂；具备生物活性如免疫活性、外多抗肿瘤以及抗溃疡，糖提可运用于医药畛域，取纯份子量约莫为4.0×10⁴～6.0×10⁶之间。化工尽管临时以来钻研者们对于乳酸菌产EPS的艺钻研化学组成存在着不同，可是乳酸乳球较不同觉患上：从乳酸菌中别离患上到的胞外聚合物是由α-以及β-衔接糖重复单元所组成的多糖，而且区别乳酸菌渗透的EPS规范区别。尽管单糖组成可能有些相似，多为半乳糖、葡萄糖以及鼠李糖，可是各成份比率区别。因为发酵液中EPS的产量较低、卵白质含量较高，给EPS的提取带来较大难题。因此，发酵液中提取EPS工艺紧张即是卵白质的作废与EPS的积淀，可患上到晃动、易运用、杂质少的多糖产物。本试验对于乳酸乳球菌发酵液经由差此外条件妨碍提取纯化EPS，验证最佳除了卵白条件以及多糖积淀条件，为工业化斲丧乳酸菌胞外多糖奠基事实根基。

一、资料与方式

一、资料与试剂

乳酸乳球菌乳亚种LL9（如下简称乳球菌LL9）：郑州轻工业学院试验室提供，由乳酸乳球菌乳亚种6242（中国工业微生物菌种收藏打点中间（CICC））紫外诱变，经葡萄糖耐受及乳链菌肽耐受水平筛选挑出，比照生物活性最终筛出活性高、乳链菌肽产量高的最优化菌株。

别离纯化条件为：发酵液→削减三氯乙酸至2.5%（w/v）→500r/min搅拌5min→4℃积淀除了卵白20min→10000r/s离心20min除了菌体→上清液透析12h→苯酚硫酸法测定EPS。可患上乳酸菌胞外多糖的产量为262.63mg/L。

6%的苯酚溶液：精确称取6.0g重蒸酚晶体，用大批的蒸馏水消融后倒入100mL的容量瓶中，定容、短缺摇匀，倒入棕色试剂瓶中备用。

二、试验方式

（1）菌种活化

保存于甘油管中乳球菌LL9接种于MRS液体作育基内，37℃作育，传代2～3次后，染色镜检，筛选优异菌株，转接斜面作育，4℃冰箱冷藏收藏备用。

（2）摇瓶发酵

活化后菌液5%转入摇瓶发酵，37℃恒温150r/min震撼作育24h。

（3）发酵液解决

取发酵尽头发酵液，10000×g下离心8min去除了菌体，取上清液备用。

（4）苯酚硫酸法测定

EPS该方式较适应乳酸菌EPS检测，相对于误差为0.2%，具备较好的精确性。透析液经稀释取2.0mL退出1.0mL6.0%的苯酚溶液，5.0mL95.0%的浓硫酸，静置10min，高速振荡器上振荡摇匀，静置20min至冷却。490nm测定OD值。规范曲线上查找对于应糖含量，即患上乳酸菌胞外多糖产量。

（5）提取纯化工艺流程

斜面→MRS液体作育基活化两次（37℃，24h）→摇床扩充作育（37℃，150r/min，24h）→离心去除了菌体（5mL，10000×g，8min）→削减三氯乙酸50%（w/v）（12h）→500r/min搅拌5min→离心积淀除了卵白（4℃，18000×g，30min）→上清加乙醇积淀多糖（100%，3倍体积，4℃，解决12h）→离心（12000×g，30min）→冷冻去世板→积淀温水消融（稀释10倍）→透析MD34（4℃，解决12h）→苯酚-浓硫酸法测定OD值→EPS纯度判断

二、服从与合成

一、苯酚硫酸规定范曲线绘制

用葡萄糖作为规范物，绘制规范曲线。由图1可知，糖浓度在0～32mg/L时，糖浓度以及透光度呈线性关连。

二、除了卵白条件优化

（1）除了卵白中三氯乙酸浓度的优化

将发酵液经由离心的方式作废菌体后，分说退出30%、40%、50%的三氯乙酸溶液1/5体积，品评辩说区别三氯乙酸浓度对于卵白质积淀的影响，如图2所示。三氯乙酸浓度在30%～50%时与发酵液多糖产量呈正比关连，三氯乙酸浓度过高会对于多糖的结构产生影响，因此开始判断除了卵白阶段三氯乙酸的最优浓度为50%。

（2）除了卵白中离心力优化

本试验中发酵液细胞别离后，退出50%的三氯乙酸溶液1/5体积，分说在10000×g、12000×g、13000×g、16000×g离心力下离心30min，选取最优化离心条件，如图3所示。在离心力16000×g时，多糖患上率达到最大值，选16000×g为最优离心力。

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