1.2.4 摇瓶发酵斲丧CAD及卵白质检测

将-80℃保存的谷氨杆菌重组菌B.subtilis/pHY300PLK-gadB以体积分数0.2％接种至含20μg/mL四环素的LB液体作育基中,恒温摇床37℃、200r/min扩充作育8～10h，酸脱羧酶再以体积分数5％转接至含20μg/mL四环素的枯草TB发酵作育基中，恒温摇床37℃、芽孢用200r/min作育2～3h后分说退出未必浓度的表白PLP、PL、及运PN，谷氨杆菌于恒温摇床33℃、酸脱羧酶200r/min妨碍重组卵白质的枯草表白。发酵历程中在区别光阴取样，芽孢用测0D₆₀₀。表白12000r/min离心1min患上到菌体以及发酵上清液。及运将菌体用1mL、谷氨杆菌50妹妹ol/L、酸脱羧酶pH5.0的枯草Na₂HP0₄-柠檬酸缓冲液重悬，退出0.6mg/mL溶菌酶，在37℃反映30min后置于冰水中超声破碎，12000r/min离心5min患上到破壁上清液以及破壁积淀，运用SDS-PAGE检测其卵白质。

1.2.5 重组CAD酶活测定底

物溶液配制：0.1mol/L-水谷氨酸钠以及0.15妹妹ol/LPLP溶于50妹妹ol/L、pH4.5的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液中，置于4℃避光保存。

反映系统：将装有360uL底物溶液的1.5mLEP管于37℃水浴锅预热10min后，退出40uLGAD粗酶液，在37℃下反映4min后，退出600uL、0.2mol/L、pH10的硼酸缓冲液妨碍反映，置于滚水中灭活10min。

GABA天生量测定：接管HPLC-OPA氨基酸柱前衍生法检测GABA天生量。

酶活界说：在反映液中，1min催化底物转化天生1umolGABA所需的酶量为一个精力单元(U)。

本文中重组GAD均指重组菌所产的GAD。

1.2.6 重组菌全细胞制备GABA工艺流程

1) GABA的制备

水配制品质浓度为127g/L的一水谷氨酸钠底物(折算成100g/L谷氨酸，如下均以折算后的谷氨酸品质浓度妨碍论述)。在150mL三角锥形瓶中退出20mL底物，退出未必量的湿菌体(在55℃水浴锅预解决50min，改善细胞膜的透明性)，反映历程中，每一隔2h用0.6mol/L的H₂SO₄以及NaOH调节pH，使其始终与初始pH不同。在未必温度、pH下，150r/min水浴摇床中反映一段光阴，妨碍反映后妨碍煮沸解决，12000r/min离心5min患上上清液，适量稀释并过0.22μm有机滤膜后用HPLC-OPA柱前衍生法妨碍检测。

2) GABA天生量的测定

将过滤好的样品经由HPLC检测GABA天生量。HPLC色谱条件如下：Agilent1200HPLC色谱仪、Agilent被动进样器、GLInertsilODS-3液相柱、Agilent紫外检测器。行动相A：精确量取995mL清白水，退出4.52g无水乙酸钠，搅拌使其短缺消融，再退出5mL四氢呋喃以及0.2mL三乙胺，之后用冰乙酸调节pH至7.20±0.05，短缺搅浑后用0.22μm有机纤维素滤膜过滤备用：行动相B：精确量取200mL清白水，退出4.52g无水乙酸钠，搅拌使其短缺消融，用冰乙酸调节pH至7.20±0.05后，再挨次退出400mL色谱纯的乙腈以及甲醇，用冰乙酸调节pH至7.20+0.05，搅浑后用0.22μm有机尼龙滤膜过滤备用。梯度洗脱，流量为0.8mL/min，柱温为40℃。依据罗致峰面积以及GABA规范品峰面积合计GABA天生量，合计公式如下：

式中：Y为GABA转化率，％；4为谷氨酸转化天生GABA的实际品质浓度，g/L；T为谷氨酸转化天生GABA的事实品质浓度，g/L。

2 服从与品评辩说

2.1 产谷氨酸脱羧酶重组菌的构建

以试验室保存的质粒pET-24a(+)-gadB为模板，扩增gadB指标片断，并以质粒载体pHY300PLK为模板，扩增表白载体片断。扩增患上到的产物用琼脂糖凝胶电泳检测，指标基因片断gadB以及质粒表白载体pHY300PLK长度约为1428bp以及5731bp，与事实碱基巨细不同。验证精确后经由ExnaseⅡ衔接酶将两个基因片断衔接再转入E.coliJMl09体味态细胞，涂布到LB固体作育基(含氨苄青霉素抗性)后挑取单菌落至LB液体作育基(含氨苄青霉素抗性)中住宿作育。提取质粒，酶切验证以及测序乐成后，将重组质粒用电击转化法导入表白宿主B.subtilis并涂布到LB固体作育基(含四环素抗性)，之后挑取单菌落至LB液体作育基(含四环素抗性)中作育8～10h，提取质粒后妨碍酶切验证合成。服从见图3，分说在5130bp以及2100bp处有清晰的条带，诠释重组表白质粒pHY300PLK-gadB在B.subtilis中构建乐成。

2.2 分说削减辅酶及辅酶前体对于重组菌摇瓶发酵的影响

2.2.1 削减区别种类辅酶及辅酶前体对于重组菌产酶状态的影响

种类辅酶及辅酶前体对于重组菌产酶状态的影响重组菌遵照1.2.4妨碍摇瓶发酵产酶，摇瓶发酵温度33℃，在重组菌发酵历程中分说削减辅酶PLP(简称GAD-PLP)、辅酶前体PL(简称GAD-PL)以及PN(简称GAD-PN)至终浓度为0.5妹妹ol/L。发酵结束后12000r/min离心1min取患上菌体，用超声波细胞破碎捣毁机妨碍细胞破碎，12000r/min离心5min患上到GAD粗酶液。服从见图4，诱导48h后，酶活分说达到25.40、28.14U/mL以及15.55U/mL，是比力GAD-0酶活(16.34U/mL)的1.5五、1.72以及0.95倍。由此可知，削减0.5妹妹ol/LPN时，酶活相较于比力并无清晰区别，这是因为枯草芽孢杆菌中贫乏PdxH氧化酶，无奈经由PLP填补蹊径将PN转化为PLP，从而普及GAD酶精力。其次随着诱导作育光阴的缩短，细胞内分解的大批PLP被自身罗致并斲丧而无奈知足GAD表白水平普及的需要。可是向作育基巾削减过多的PLP或者PL可能间接或者问接经由PLP填补蹊径分解PLP，从而提供可能连结GAD晃动的辅酶PLP，增长GAD的折叠，普及酶活。鉴于PLP老本高于PL，以是在发酵历程入抉择削减PL妨碍后续试验。

2.2.2 区别吡哆醛浓度对于重组菌产酶状态的影响

重组菌遵照1.2.4妨碍摇瓶发酵，在历程中削减区别浓度的PL(0.0一、0.0三、0.0五、0.0七、0.一、0.二、0.3妹妹ol/L)发酵作育48h后，12000r/min离心1min取患上菌体，超声波细胞破碎机妨碍细胞破碎，12000r/min离心5min患上到GAD粗酶液，服从见图5。随着PL浓度的削减，GAD酶活也随之普及，当PL浓度为0.1妹妹ol/L时，GAD酶活达到最高为28.28U/mL。不断削减PL的浓度，酶活并未发生清晰变换，故可知PL的最适削减浓度为0.1妹妹ol/L。图6为发酵历程中削减区别浓度PL后的重组GAD卵白质电泳图，从图中可见在相对于份子品质53000的条带左近有一条清晰的卵白质电泳条带，适宜GAD事实卵白质相对于份子品质巨细。

2.2.3 削减吡哆醛先后重组菌发酵历程比照

重组菌遵照1.2.4妨碍摇瓶发酵，在历程中削减0.1妹妹ol/LPL，探究其在区别发酵光阴(0、十二、2四、3六、4八、60h)对于重组菌愿望(见图7)以及产GAD状态(见图8)的影响。与GAD-0比照，在发酵时问36h左右，PL对于菌体的愿望有未必的增长作州，是因为存卵白质表白历程中，经由PLP填补蹊径，PdxK激酶将PL磷酸化组成PLP，增长GAD的折叠，未必水平上有利于菌体愿望。随着发酵时问的缩短，南于PLP晃动性差而患上到浸染,导致菌体的愿望有所着落。由图8可知，与GAD-0比照，GAD-PL酶活最高达到28.28U/mL，削减过多的PL可能提提供GAD未知浓度的PLP，从而普及GAD酶活。

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相干链接：谷氨酸钠，氧化酶，琼脂糖凝胶