1.3.6 生物膜组成能耐的维氏测定

参照KuSada等的方式，接管结晶紫染色法合成大蒜提取物对于细菌生物膜组成能耐的气单群体取物影响。将细菌作育液按1∶1000的胞菌比例稀释，退出无菌96孔板中，中介征兆退出区别浓度的导的的干大蒜提取物（终品质浓度为0.15～1.20mg/mL），30℃静置作育24h。蒜提移除了作育液，扰浸染用无菌去离子水冲洗3次，维氏无菌风去世板，气单群体取物退出200μL0.1%结晶紫染色液，胞菌室温染色15mIn，中介征兆无菌水冲洗3次，导的的干退出1mL95%乙醇漂洗生物膜，蒜提将洗液于波长570nm处测定OD值。扰浸染

参照PackIavaThｙ等的维氏方式，运用激光共聚焦显微镜（cLSm）合成细菌生物膜结构的变换。将细菌作育液按1%的比例接入含1mLLB作育基的24孔板中，退出1.20mg/mL大蒜提取物以及直径为1cm的圆形盖玻片，静置作育24h。用无菌水僻静冲洗玻片上未粘附的细胞，0.1%吖啶橙染色1mIn。洗去过剩的染色液，将盖玻片置显微镜下审核。该显微镜装有激发波长为515～560nm的激发滤光器及60×（60倍）的油镜，其荧赫然微镜照片与光镜照片均由FluovIewv5.0软件取患上

1.3.7 基因表白量的测定

接管实时荧光定量PcR（RT-PcR）技术。细菌活化后退出1.20mg/mL大蒜提取物作育24h，运用细菌RnA提取试剂盒提取细菌RnA。在20μL反映系统中，退出10μL2×荧光定量PcR预混系统，0.4μL10μmol/L上、鄙俚引物，2μLcDnA模板。PcR扩增挨次为：预变性95℃3mIn，变性95℃7S，退火57℃10S，缩短72℃15S（45个循环）。相对于表白量（RQ）由2-ΔΔcT方式合计患上出。

1.3.8 细菌糜烂能耐的测定

参照Zhao等的方式制备无菌鱼糜肉汁。冷冻鱼糜解冻后，按品质比1∶1加水打浆，加热煮沸5mIn后静置，冷却至室温。用2层纱布过滤患上鱼糜肉汁，退出1.6g/L氧化三甲胺、40mg/LL-半胱氨酸以及40mg/LL甲硫氨酸，搅浑平均后于121℃低压灭菌15mIn，患上无菌鱼糜肉汁。无菌条件下，在鱼糜肉汁中削减区别品质浓度的大蒜提取物（终品质浓度为0.15～1.20mg/mL）。将制备好的细菌菌悬液接种至无菌鱼糜肉汁中，于30℃中摇床作育48h，每一距离6h取样，测定鱼糜肉汁中TVB-n以及腐胺含质变换。

TVB-n的测定参照赵丹丹等的方式，取5mL样品，退出15mL0.6mol/L高氯酸溶液均质混匀，上清液用半被动凯氏定氮仪测定。腐胺含量的测定参照Zhao等的方式，取2mL样品，退出25mL0.4mol/L高氯酸溶液均质混匀，上清液用丹磺酰氯衍生后勤勉用液相色谱合成。

1.4 数据统计合成

运用SPSS21.0软件以及OrIgIn8.5软件合成数据。测定服从以均值±规范差（n≥3）呈现，接管最小清晰差距法（LSD）妨碍清晰性差距合成，清晰性水平为5%。

2 服从与合成

2.1 维氏气单胞菌产AHLs信号份子的种类

以根癌农杆菌为陈说菌，运用平行划线法合成维氏气单胞菌的AHLS份子产生状态，服从见图1。细菌产生的AHLS可经由琼脂散漫诱导根癌农杆菌产生β-半乳糖苷酶，并分解底物X-gal产生蓝色色素。由图1可知，维氏气单胞菌可产生AHLS类信号份子并诱导根癌农杆菌显蓝色。

根癌农杆菌对于区别碳链长度或者带有区别基团的AHLS份子锐敏水平区别，这些AHLS经TLc睁开，在作育基响应的位置诱导根癌农杆菌泛起蓝色黑点。依据黑点的比移值、形态以及色调深、浅可直不雅分说AHLS的种类及相对于含量。对于维氏气单胞菌的AHLS提取液的TLc合乐成果见图2。合成可知，该细菌至少产生3种AHLS份子，即：c6-HSL、c7-HSL以及c8-HSL。c4-HSL与c6-HSL是当初气单胞菌属报道至多的2种AHLS信号份子。LI等在糜烂比目鱼中别离的以及顺气单胞菌中检测到c4-HSL、c6-HSL、c8-HSL、N-癸酰基-高丝氨酸内酯（c10-HSL）以及n十二酰基-高丝氨酸内酯（c12-HSL）。本试验在维氏气单胞菌中检测到侧链上的碳原子数目为奇数的AHL信号份子，即c7-HSL。

2.2 维氏气单胞菌生前途程中AHLs活性变换

细菌产生的AHLS份子浓度受细菌密度变换影响，区别愿望阶段的细菌AHLS提取液能诱导根癌农杆菌产生区别直径的蓝色圈。维氏气单胞菌生前途程中的细菌总数与作育液PH值的变换见图3，AHLS活性变换见图4。合成可知，细菌作育4h时处于对于数生临时早期，此时细菌渗透的AHLS可诱导根癌农杆菌显蓝色。在4～10h细菌的快捷愿望阶段，根癌农杆菌的变色直径不断增大，诠释AHLS的含量快捷积攒。在10～18h时，根癌农杆菌蓝色圈的直径最大，此时作育液中AHLS浓度最高。在18～48h，细菌处于愿望晃动期，诱导陈说菌变色的直径减小，诠释AHLS的浓度开始着落。钻研发现，AHLS含量的削减与情景PH值着落无关。AHLS的高丝氨酸内酯环在碱性条件下结构不晃动，易解环。对于细菌生前途程中作育液的PH值变换的合成表明：细菌作育18h后作育液的PH值由6.92增至8.11，作育48h时PH值达8.97。随着细菌的愿望，作育液的PH值不断着落，AHLS开始降解，活性着落。

2.3 维氏气单胞菌的基因合成

革兰氏阴性菌AHLS介导的群体感应系统主要由luxRI的同源基因调控。运用PcR技偶合成维氏气单胞菌中的luxRI同源基因，服从见图5a。合成发现2个片断序列分说为转录调控因子AcuR以及自诱导基因AcuI，这与ＪangId等的钻研服从相同，该学者初次在维氏气单胞菌mTcc3249中检测到AcuRI群体感应系统。此外，合成维氏气单胞菌的氨基酸脱羧酶基因以及毒力基因，服从见图5b、5c。鸟氨酸脱羧酶基因（ODC）以及赖氨酸脱羧酶基因（LDC）的检出诠释该细菌具备产腐胺以及尸胺的能耐，胞外酶基因（AhyB，ser，liP）的检出诠释该菌具备未必的卵白酶活性以及脂肪酶活性，鞭毛基因（flA）的检出诠释该菌具备鞭毛行动以及组成生物膜的能耐。

2.4 大蒜提取物对于维氏气单胞菌产AHLs的抑制作用

大蒜提取物对于维氏气单胞菌的最小抑菌品质浓度为2.5mg/mL（数据未呈现）。本试验抉择低于此品质浓度的系列（0，0.15，0.3，0.6，1.2mg/mL）来钻研大蒜提取物对于维氏气单胞菌群体感应的干扰浸染。

经由检测生物陈说菌根癌农杆菌的β-半乳糖苷酶活性来合成区别浓度大蒜提取物对于维氏气单胞菌产生AHLS活性的干扰浸染，服从见图6。合成可知，随着大蒜提取物资量浓度的削减（0～1.20mg/mL），根癌农杆菌的β-半乳糖苷酶活性不断着落（P＜0.05）。这诠释大蒜提取物对于维氏气单胞菌产AHLS活性具备清晰的抑制作用（P＜0.05），且大蒜提取物的品质浓度与其群体感应抑制活性呈清晰量效关连。大蒜提取物资量浓度为1.20mg/mL时对于根癌农杆菌的β-半乳糖苷酶活性的抑制率最高，为39.6%。这可能是因为此品质浓度下维氏气单胞菌AcuR卵白与群体感应抑制活性物资的散漫力最强，抑制了AHLS份子的转录表白。

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