鲨鱼肝油是中性烷基甘油、角鲨烯等生物活性物资的氧化紧张源头，具备优异的铝柱心理保健功能。烷基甘油是层析纯化醇废成合成一种醚脂质化合物，依据甘油骨架上衔接的别离烷烃链饱以及度与长度的区别，主要分为鲨肝醇(十八烷氧基甘油)、鲨肝鲨油醇(十八-烯烷氧基甘油)、品及鲛肝醇(十六烷氧基甘油)等。其组其中，中性鲨肝醇是氧化烷基甘油紧张的组成全副。具备坚持因细胞毒类药物或者苯中毒引起的铝柱造血系统抑制，抗癌、层析纯化醇废成合成防癌，别离增长白细胞增生及抗喷射线等浸染，鲨肝是品及紧张的免疫鼓舞因子。当初鲨肝醇富集工艺较为不可熟且区别质料中的鲨肝醇含量错落不齐，在售的鲨肝醇产物为富含鲨肝醇的鲨鱼肝油，大多为化学分解，而化学分解的鲨肝醇存在生物活性成果低下等成果。

当初，国内外鲨肝醇别离、纯化的方式主要有超临界流体法、份子蒸馏法、酯替换法、柱色谱法、薄层色谱法(TLC)等。Vazquez划一接管超临界流体萃取技术别离、纯化鲨鱼肝油中的鲨肝醇，患上到高纯度的鲨肝醇。可是，超临界流体萃取法配置装备部署投入高，操作相对于重大。郭正霞运用氧化铝柱层析技术别离、纯化鲨肝醇，使鲨鱼肝油不皂化物中鲨肝醇含量清晰普及。其未审核洗脱液、洗脱流速等因素对于柱层析成果的影响。本钻研以鲨鱼肝油中不皂化物为质料。接管中性氧化铝柱层析别离、纯化鲨肝醇的工艺，经由气相色谱法(GC)与薄层层析法(TLC)合成制备样品中角鲨烯等活性物资，以期为鲨肝醇富集工艺及鲨鱼肝油的高值化运用提供技术反对于。

1 资料与方式

1.1 资料与试剂

粗制鲨鱼肝油，海力生总体有限公司：鲨肝醇标品(纯度≥98％)、硅烷化试剂(V_BSIFA：V_TMCS=99:1)、100～200目中性氧化铝，国药总体化学试剂有限公司；角鲨烯标品(纯度≥99％)，美国Sigma公司；氢氧化钾、乙醇(95％)、盐酸、二氯甲烷、正己烷、无水甲醇、乙醚、乙酸等均为合成纯级，国药总体化学试剂有限公司。

1.2 仪器与配置装备部署

7890B气相色谱仪，美国Agilent公司；电子天平AL204型，梅特勒-托利多有限公司；层析柱(φ3.0cm×60cm)、硅胶板(φ5.0cm×10.0cm)，国药总体化学试剂有限公司；旋转蒸发仪RE-3000，上海亚荣生化仪器厂：SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工商业有限工艺；BT50S蠕动泵，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司：Fresco-21G台式离神思，美国ThermoFisher公司：Milli-pore超纯水系统，美国Millipore公司。

1.3 试验方式

1.3.1 不皂化物的提取参

考GB/T5535.2-2008《动动物油脂不皂化物测定第2全副：己烷提取法》以及叶虔臻等的方式提取鲨鱼肝油中不皂化物。称取50g鲨鱼肝油于500mL三颈烧瓶中，退出150mL1mol/L氢氧化钾-乙醇溶液，在70℃条件下反映50min。待反映结束后，从冷凝管顶部退出150mL蒸馏水，冷却至室温，再将反映液倒入500mL分液漏斗中，用200mL正己烷萃取3次。并吞萃取液，而后用10％乙醇水溶液洗涤萃取液至中性。若在洗涤历程中泛起乳浊征兆，则加大批无水乙醇破乳。萃取液经无水硫酸钠脱水、旋蒸患上不皂化物，充氮后高温保存备用。

1.3.2 层析柱的制作

参考龚金炎等的方式制作中性氧化铝层析柱。称取250g粒径100～200指标中性氧化铝与500mL蒸馏水搅浑，退出浓盐酸，调节溶液pH值至2，连结10min后用蒸馏水洗涤至中性。置105℃条件下活化24h。接管干法装柱。待氧化铝界面再也不着落。用二氯甲烷洗脱除了柱子中的杂质，失调2h，静置待用。

1.3.3 TLC检测

参考郭正霞的方式对于样品妨碍TLC检测，并作适量更正。详尽操作如下：取硅胶板置于103℃条件下去世板活化1h。放入去世板器中冷却至室温待用。称取样品100mg消融于1mL二氯甲烷中，毛细管点样于TLC硅胶板上，以V_正己烷:V_乙醚:V_乙酸=85:15:1为睁开液，碘蒸气显色。

1.3.4 GC测定鲨肝醇

将TLC硅胶板上对于应的鲨肝醇条带刮下，退出500μL硅烷化试剂(V_BSTFA:V_TMCS=99:1)，于65℃水浴30min，冷却后氮气吹扫，脱除了过剩溶剂后退出2mL正己烷复溶，过滤待测。退出硅烷化试剂的指标是妨碍衍生化解决。

气相色谱条件：HP-5毛细管色谱柱(30m×0.32妹妹，0.25μm)；升温挨次：初温200℃连结5min后，以5℃/min升至280℃，连结20min；进样口温度250℃，不分流进样，进样量1μL，载气流速1mL/min。因鲨肝醇规范品需衍生化解决前方可GC检测。故无奈绘制规范曲线。本试验接管峰面积归一化法合成鲨肝醇的纯度。每一组样品重复测试3次。

1.3.5 GC测定角鲨烯气

相色谱条件：HP-5毛细管色谱柱(30m×0.32妹妹，0.25μm)；升温挨次：初温160℃，以15℃/min升至220℃，连结2min；而后以5℃/min升至280℃，连结20min；最后以5℃/min升至300℃，连结2min。进样口温度250℃，分流比1:10，进样量1μL，载气流速1mL/min。每一组样品重复测试3次。

精确称取25mg角鲨烯规范品于25mL容量瓶中，退出大批正己烷定容至刻度，配制1mg/mL角鲨烯规范蕴藏液。分说取未必量的规范蕴藏液用正己烷稀释。配成品质浓度分说为20，50，100，200，400μg/mL及800μg/mL的规范使命液。以各品质浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制角鲨烯规范曲线。

1.3.6 响应面试验妄想

在单因素试验的根基上，依据DesignExpert8.0软件中的Box-Behnken妄想中间组合试验，选取洗脱液比例、上样量以及洗脱流速3个因素，每一40mL为1个收集单元，以鲨肝醇纯度为响应值，做三因素三水平的中间组合试验，以判断氧化铝柱层析别离富集鲨肝醇最佳工艺参数。响应面因素水平及编码值见表1。

相干链接：氧化铝柱，角鲨烯，二氯甲烷，乙醚

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