酶精力对于AFs降解率的重组影响:将酶精力分说为一、二、漆酶三、降解及产4U以及5U的黄曲合成漆酶分说与10μL0.1mg/mL的AFB1规范溶液涡旋振荡混匀，30℃、霉毒200r/min孵育12h。份对比力组为退出划一体积的于接pH5.7的0.1mol/L的PBS₁其余条件相同。一着实施重复3次，物结降解率按式（1）合计:

（8）AFs的构剖提取

将孵育光阴对于AFs降解率的影响:将酶精力为3U的漆酶与10μL0.1mg/mL的AFB₁规范溶液涡旋振荡混匀，置于30℃、重组200r/min分说孵育十二、漆酶2四、降解及产3六、黄曲合成48h以及60h。霉毒比力组为退出划一体积的份对pH5.7的0.1mol/L的磷酸缓冲盐溶液（phosphatebuffersaline，PBS），其余条件相同。孵育温度对于AFs降解率的影响:将酶精力为3U的漆酶与10μL0.1mg/mL的AFB₁规范溶液涡旋振荡混匀，分说置于2五、30、3五、40℃以及45℃温度下，200r/min孵育12h。比力组为退出划一体积的pH5.7的0.1mol/L的PBS，其余条件相同。酶精力对于AFs降解率的影响:将酶精力分说为一、二、三、4U以及5U的漆酶分说与10μL0.1mg/mL的AFB₁规范溶液涡旋振荡混匀，30℃、200r/min孵育12h。比力组为退出划一体积的pH5.7的0.1mol/L的PBS₁其余条件相同。解决的样品12000r/min离心30s，使管壁上的发酵液离心至管底部，并转移至10mL的具塞玻璃管中，向玻璃管中退出等体积的三氯甲烷（在透风处妨碍），涡旋振荡10min使其短缺混匀，而后倒入离心管中，静置30min分层，取下层液体于玻璃管中，退出等体积三氯甲烷，排汇下层有机相清液于离心管中，相同操作重复3次。并吞3次有机相于氮吹管中，于45℃氮气吹干。再用甲醇溶液消融出AFs，并用0.22μm滤膜过滤。

（9）HPLC-MS/MS检测AFs及规范曲线的绘制

配制的毒素规范溶液以及提取的毒素溶液均用0.22μm滤膜过滤至液相小瓶中。

HPLC条件:液相模块为安捷伦1260Infinity:Inertsil0DS-3C18色谱柱（150妹妹X4.6妹妹，3μm）；流速0.2mL/min；进样量5μL；行动相A为0.1%甲酸溶液，行动相B为甲醇-水（3:7，V/V）；合成光阴30min；检测温度30℃。

MS/MS条件:电喷雾离子源:监测模式:多反映监测；离子源温度300℃:锥孔电压15psi；碰撞电压135V；碰撞能量30eV:毛细管电压4kV；品质扫描畛域m/z313.0～285.0。

（10）响应面试验妄想

在单因素试验根基上，以孵育光阴、孵育温度以及酶精力作为审核因素，以AFB₁降解率为响应值，响应面试验妄想因素与水平如表1所示。

（11）AFB₁降解产物的测定及结构剖析

HPLC条件:ZORBAX-SBC18色谱柱（100妹妹X2.1妹妹，3.5μm）。行动相A为0.1%甲酸溶液，行动相B为0.1%甲酸-甲醇溶液。梯度洗脱挨次:40%B，6min；60%B，连结16min；100%B，8min；总共运行30min。进样量5μL，流速0.4mL/min，柱温箱30℃。

MS条件:雾化气GS1压力50psi；雾化气GS2压力50psi；气帘气压力35psi；离子源温度550℃:离子源，电压5500V；一级扫描去簇电压100V；聚焦电压10V；品质扫描畛域m/z100～1500；二级扫描接管TOFMS-Productlon-IDA模式网络质谱数据，诱导碰撞解离能量分说为20、40V以及60V，进样前，用蠕动泵做品质轴校对于，使品质轴误差小于0.002%。

二、服从与合成

一、漆酶的同源模立服从

在本试验所用漆酶晶体结构未被剖析的状态下，运用某些已经知漆酶晶体结构的根基上同源模建可能，最洪流平上取患上事实的指标卵白三维结构。运用ChemBioDraw2014软件以及MOEv2014.0901软件绘制并转换成三维结构，如图1所示。钻研AFs与该酶的散漫模式首先需要构建同源模子，服从如表2以及图2所示。图3合成呈现，99%的漆酶残基位于卵白构像的公平区域，这表明本试验构建的漆酶同源模子适宜平面化学规定，具备公平性。

二、漆酶与AFB₁的相互浸染合成

接管份子对于接伎俩钻研AFB₁与栓菌漆酶外表的相互浸染，旨在合成AFB₁与漆酶相互浸染模式。为清晰漆酶以及毒素的散漫模式，接管诱导适宜的策略，依据配体的构象侧链受体口袋应承挪移适应，将毒素分说对于接到漆酶的活性部位，患上到漆酶精力位点与配体的散漫模式，如图4所示，对于接打分为-6.4532kca/mol。
 

依据所构建的对于接模子，如图4所示，AFB₁上甲氧基的氧原子可作为氢键的受体，与漆酶上一个高度激进同时也挨近铜离子（T1CuI）位置的His481上氨基酸侧链组成氢键，此外，AFB₁呋喃环上的氧原子也可能作为氢键的受体，与漆酶Asn288的侧链组成氢键，因此，His481以及Asn288是漆酶以及AFB₁散漫时的紧张氨基酸位点，经由氢键相互浸染。

酶-配体的散漫亲以及力与其相互浸染的功能无关，受到配体的结构特色以及扭曲水平以及配体以及酶外表之间形态互补的影响。有钻研表明氢键是酶与配体相互浸染的紧张浸染力，退出氢键组成的氨基酸残基被觉患上是漆酶与小份子配体相互浸染的紧张残基。其中氧原子与氨基酸残基组成的氢键浸染强于碳原子与氨基酸残基组成的氢键，且氢键键长越短，浸染越强。对于接模拟钻研表明，存在于T1铜配位层中的激进的残基His481最可能与AFs发生相互浸染，组成氢键，判断其可能介导氧化历程中的电子转移，普及电子传递功能，从而普及漆酶催化能耐。综合多方面原因造成酶对于毒素的浸染能耐存在差距，呈现为对于接分数区别。

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