动物寄生线虫是栀根限度全天下食粮斲丧的严主因素之一。据统计，结线全天下因动物寄生线虫造成的虫病损失约800亿美元，其中根结线虫宽泛扩散于天下各地，病断是原判危害极大的一类动物寄生线虫。当初根结线虫的栀根防治措施包罗种植抗病种类、运用化学杀线剂、结线连作、虫病生物防治等，病断其中线虫种类判断是原判种种防治措施实施的根基。

栀子又名黄栀子，栀根属茜草科栀子属动物，结线是虫病我国传统的中药材，不光可能间接入药，病断其果实仍是原判提取食用色素削减剂“黄色素”的人造低劣资料。栀子扩散于广西、河南、浙江、江西、福建、湖北等地，种植栀子可增长产地农人增收，是当初广西贺州、柳州等地工业扶贫的实用蹊径。可是，栀子斲丧面临严正的病害成果，其中根结线虫病是其中一种紧张的病害，在区别区域均有区别水平发生。熊英等、贾全全等、李冬等等相继在广西柳州、江西等地发现该病害，但少数钻研会集于病害发生状态审核及药剂筛选方面，病原相干报道较少，仅有广西柳州、福建福鼎两地对于其病原妨碍了判断。2018—2020年对于广西贺州市的栀子种植基地妨碍审核，发现栀子受到根结线虫的危害，泛起植株长势差，叶片黄化、萎蔫、根系组成少许根结等症状，严正限度当地栀子种植工业的发展。本钻研对于网络到的栀子根系及其根际土壤妨碍别离，对于别离患上到的根结线虫二龄幼虫及雌虫妨碍形态审核及份子生物学判断，旨在清晰栀子根结线虫病病原种类，为该病的实用打点提供事实依据。

1 资料与方式

1.1 供试线虫的网络及别离

线虫样本采自贺州市八步区莲塘镇旗头岭文坡村落、上寺村落栀子种植基地，接管五点取样法挖取泛起根结线虫病症状的栀子根系及其根际土壤带回试验室。在剖解镜下，从根结挑取单卵块部署25℃恒温箱孵化成二龄幼虫，将二龄幼虫接种于预先作育于消毒土的栀子（贺栀1号）根部，妨碍活体保存，待用。试验时挖取根结线虫病症状清晰的栀子根系及根际土壤，接管间接剖解法别离雌虫，将根系置于体视镜下用3号昆虫针挑取雌虫妨碍形态学审核；根际土壤接管改善贝曼漏斗法妨碍别离，25℃静置24h后，用小玻璃瓶搜粗放10mL线虫悬浮液。在体视镜下将根结线虫二龄幼虫从线虫悬浮液中挑出，经热杀去世后制成临时玻片用于形态审核。

1.2 形态学判断

二龄幼虫及雌虫主要形态特色：运用尼康显微镜审核其头部、口针、尾部特色，并接管deMan公式对于20条二龄幼虫妨碍丈量，分说丈量体长、最概况宽、口针长度、尾长、透明尾长以及DGO（背食道腺闭口至口针基部球的距离）等形态指标。

会阴花纹的制作及审核：参照张绍升的方式，从栀子根机关挑取成熟雌虫，部署滴有10μL40%乳酸的载玻片上，在体视显微镜下用手术刀切取虫体后部约1/4并将体内机关去除了，用镊子将会阴花纹转移至滴有10μL纯甘油的载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下审核摄影。

1.3 份子生物学判断

1.3.1 线虫DNA提取

线虫DNA抽提接管单条线虫DNA提取法。参照王江岭等的方式略有改动，在经灭菌的凹面皿上滴入16μLddH2O以及2μL10×PCRBuffer搅浑液，用挑虫针将单条根结线虫二龄幼虫挑入搅浑液中，取1号昆虫针将线虫切成2～3段，用移液器将含有线虫段的所有搅浑液转移至200μLPCR管中，退出2μL（1mg/mL）卵白酶K，-80℃超高温冰箱部署20min，65℃温育60min，95℃加热10min，取患上DNA提取液。DNA提取液可赶快用于PCR扩增或者放入–20℃冰箱保存备用。

1.3.2 PCR扩增

核糖体ITS区接管引物F194:5'-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3'以及PXB481:5'-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3'妨碍扩增，28SrDNAD2D3区接管通用引物D2A:5'-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGT-3'以及D3B:5'-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3'妨碍扩增。PCR反映系统（50μL）：TaKaRaTaqHSPerfectMix(2×)25μL，鄙俚引物（10μm）2μL，鄙俚引物（10μm）2μL，模板DNA2μL，ddH2O19μL。扩增条件：94℃4min；94℃40s，55℃40s，72℃1min，共35个循环；最后725min。PCR产物妨碍1%Agarose胶电泳检测，PCR产物纯化后，送生工生物工程（上海）股份有限公司双向测序。

1.3.3 序列合成

PCR产物测序服从用NTI11软件妨碍序列拼接，最终序列上传至GenBank，序列号分说为MH75612一、MH75612二、MN64851九、MN648520。依据近些年来宣告的根结线虫系统进化文献，从GenBank下载相干线虫rDNA-ITS以及28SrDNAD2D3序列，接管NTI11软件妨碍多重序列比对于合成。

1.3.4 系统进化合成

接管MEGA7.0软件构建基于rDNA-ITS及28SrDNAD2D3区的Neighborjoing系统进化树。分说抉择GenBank数据库中象耳豆根结线虫（M.enterolobii）rDNA-ITS序列（MT64850七、MT193450、MT19344九、MN01711九、MN01711五、MH800969）以及28SrDNAD2D3区序列（MT64850七、MT193450、MT19344九、MN01711九、MN01711五、MH800969），南方根结线虫（M.incognita）rDNA-ITS序列（LC030363），花生根结线虫（M.arenaria）rDNA-ITS序列（KJ57238四、AF387092）以及28SrDNAD2D3区序列（AF43580三、KJ598135），爪哇根结线虫（M.javanica）rDNA-ITS序列（AY43855五、KX646187）以及28SrDNAD2D3区序列（MT341299九、MN096736），巴拉那根结线虫（M.paranaensis）28SrDNAD2D3区序列（AF435800、KY911103），拟禾本科根结线虫（M.graminicola）28SrDNAD2D3区序列（MG27344一、MG273443），分说以朱顶红短体线虫（Pratylenchushippeastri,FJ712935）以及玻利维亚短体线虫（P.crenatus,MH973647）作为外类群，rDNA-ITS共计15条序列，28SrDNAD2D3区共计17条序列构建系统进化树，以自展法（bootstrap）妨碍1000次循环检测。

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