骨质涣散症是细胞协同一种罕有的代谢性骨病。天下卫负气关在2015年提出的水平素《对于老龄化与瘦弱的全天下陈说》指出，在国家以及全天下层面上需要重新以及不断关注改善肌肉骨骼瘦弱。染料骨重修历程取决于连结成骨细胞组成骨基质与破骨细胞消除了骨矿化之间的木素失调。成骨细胞响应骨细胞产生的维生信号，并将破骨细胞前体召募到重塑部位，骨质而后，涣散经由骨呵护素（OPG）/核因子κB配体受体激活剂（RANKL）/核因子κB受体激活剂（RANK）系统的浸染受体激活剂，成骨细胞可调节破骨细胞的细胞协同天生。

骨质涣散症主若是水平素体内维生素D缺少，钙摄入量缺少以及雌激素着落引起的染料。当初，木素人们宽泛负责雌激素替换疗法用于治疗因缺少雌激素的维生骨质涣散症患者。可是骨质其有副浸染，特意是涣散削减乳腺癌的危害。维生素D3（VitaminD₃，VD₃）是骨组成系统中的紧张退出者，在钙稳态中具备削减钙从肠道罗致的功能。饮食中摄入充实的维生素D3是须要的，其宽泛存在于油性鱼以及鳕鱼肝油中。染料木素（Genistein，Gen）是罕有的异黄酮动物雌激素化合物之一，在大豆中的含量充实，也是可食用的人造物资，可能实用着落副浸染。

当初已经有少许从细胞及动物水平上钻研对于维生素D₃概况染料木素对于骨质涣散症的影响。维生素D₃及染料木素在增长成骨细胞的分解历程中存在协同浸染，协同诱导成骨细胞活化并克制破骨细胞的分解。适量剂量的染料木素与钙以及维生素D₃散漫被视为防御以及打点骨质消散的一种新的潜在疗法。

本文在细胞水平上验证维生素D₃以及染料木素对于治疗骨质涣散症的协同浸染，并钻研维生素D₃以及染料木素在破骨细胞组成中的浸染，为经由维生素D₃治疗骨质涣散症提供试验依据。

1 资料与方式

1.1 资料与试剂

小鼠巨噬细胞RAW264.七、人成骨血瘤细胞MG-63，均购自中国迷信院上海细胞库。

DMEM作育基（无酚红）、Trizol试剂、胰卵白酶，上海生工生物有限公司；Western及IP细胞裂解液，碧云天生物技术；染料木素、维生素D₃，维克奇生物技术有限公司；二甲基亚砜（DMSO），美国Sigma-Aldrich公司；抗坏血酸、茜素红S染色液（1%，pH4.2）、西吡氯铵（CPC）、β-甘油磷酸钠，北京索莱宝科技有限公司；核因子κB受体活化因子（RANKL），美国ROCKLAND公司；胎牛血清（FBS），NQBB；抗酒石酸酸性磷酸酶染液、碱性磷酸酶（ALP）试剂盒、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）试剂盒，南京建成生物工程钻研所；噻唑蓝（MTT）、琼脂糖，美国Invitrogen有限公司。

1.2 仪器与配置装备部署

全被动凝胶成像系统，英国Syngene公司；IX71荧赫然微镜，日本Olympus公司；Flash全波长扫描荧光酶标仪、7500RealTimePCRSys-tem，美国赛默飞公司；垂直层流清洁使命台，上海传染配置装备部署有限公司；Heracell150二氧化碳作育箱、BiofugeStratos冷冻离神思，美国赛默飞公司。

1.3 试验方式

1.3.1 细胞作育

人成骨血瘤细胞MG-63以及小鼠巨噬细胞RAW264.7均在5%CO₂、37℃细胞作育箱中作育，作育基运用含10%胎牛血清（FBS）、1%双抗（青霉素以及链霉素）的无酚红DMEM作育基。

1.3.2 MTT法测定细胞增殖

取愿望状态优异的对于数生临时人成骨血瘤细胞MG-63概况小鼠巨噬细胞RAW264.7，以每一孔5×10³个接种于96孔板中。待细胞贴壁后，给药组分说退出区别浓度的染料木素、维生素D₃，比力组退出等体积的作育基。药物浸染确守光阴后吸除了96孔板中的作育基，在37℃情景下，每一孔用100μLMTT溶液（0.5mg/mL）孵育4h。小心吸除了孵育后的MTT溶液，每一孔用100μLDMSO消融紫色结晶甲瓒，以及顺混匀。运用酶标仪以630nm波短处的A值作为参照，检测570nm波短处的吸光度A值。

1.3.3 碱性磷酸酶（ALP）活性测定

人成骨血瘤细胞MG-63以每一孔2×10⁵个接种于6孔板，待细胞贴壁后，给药组削减区别浓度的药物，比力组退出等体积的作育基作育确守光阴。检测时用PBS洗2遍，每一孔退出150μL的细胞裂解液裂解细胞，置冰上30min后，4℃下离心15min，转速为14000r/min，排汇上清液置于冰上，测定ALP活性严酷遵照ALP试剂盒诠释书操作，检测波长520nm。

1.3.4 茜素红染色判断骨矿化

人成骨血瘤细胞MG-63以每一孔2×10⁵个接种于6孔板，待细胞贴壁后，矿化组以及给药组均换用含50μmol/L抗坏血酸以及10妹妹ol/Lβ-甘油磷酸钠的DMEM作育基作育，给药操作同1.3.3节。天天审核细胞状态，每一1～2d替换作育基1次。21d后在颠倒显微镜下审核，全副细胞成片积攒愿望，泛起形态各异的“黑斑”，即为矿化结节。PBS洗涤细胞2遍晾干，95%乙醇牢靠10min，蒸馏水洗涤后晾干。退出茜素红S染色液（1%，pH4.2），37℃染色60min。蒸馏水洗涤2～3遍将未散漫的染料洗掉，措施以及顺防御洗掉细胞，晾干后颠倒显微镜下摄影并记实。每一孔加1mL10%CPC溶液短缺消融深红色化合物，测定其在550nm下A值，钙结节的量与A值的巨细成正比，以定量钙聚积状态。

1.3.5 诱导破骨细胞

小鼠巨噬细胞RAW264.7，以1×10⁴/孔接种于24孔板，待细胞贴壁后，退出含50ng/mLRANKL诱导剂的作育基诱导破骨细胞天生。诱导6d后在颠倒显微镜下可审核到有多核细胞的组成，依据抗酒石酸酸性磷酸酶染液诠释妨碍染色，颠倒显微镜下审核摄影。记实到含有大于3个细胞核的TRAP阴性多核细胞为破骨细胞。

1.3.6 破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性检测

小鼠巨噬细胞RAW264.7以每一孔5×10³个接种于6孔板中，每一孔2.5mL。细胞贴壁后，给药组以及比力组均用含RANKL诱导剂（50ng/mL）的作育基作育细胞，给药组退出区别浓度的区别药物。每一1～2d替换作育基1次，作育6d。解决结束后，收集细胞，PBS洗1～2遍，每一孔退出150μL的细胞裂解液裂解细胞，置冰上30min后，在4℃下离心15min，转速为14000r/min，取上清液为总卵白置于冰上，测定TRAP活性严酷遵照TRAP试剂盒诠释书操作，检测波长530nm。

1.3.7 人成骨血瘤细胞MG-63的RNA提取及RT-PCR

MG-63细胞以每一孔1×10⁵个接种于6cm作育板，细胞贴壁后退出药物（分组及给药状态同1.3.3节）。作育24h后收集细胞。用Trizol提取总RNA妨碍RT-PCR扩增。PCR扩增反映条件：接管两步PCR反映挨次法，第一步预变性95℃、30s；第二步PCR反映，95℃、5s，60℃、34s，循环40次。指标基因mRNA水平以与参照基因GAPDH的Tm比值呈现。PCR引物序列如表1所示。

1.3.8 破骨细胞的RNA提取及RT-PCR参照1.3.6节方式解决细胞

细胞提取RNA及RT-PCR方式同1.3.7节。

1.3.9 试验数据解决及统计合成

所患上数据为x-±s呈现，n≥3，运用邓肯字母符号法符号多重比照，接管SPSS19.0统计软件妨碍方差的T魔难合成。P＜0.05差距具备清晰统计学意思。

相干链接：二甲基亚砜，胰卵白酶，抗坏血酸，西吡氯铵

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